Le logiciel de détection et d’analyse automatisées de l’exocytose permettra à l’utilisateur de détecter automatiquement les événements exocytaires et les séquences d’images TIRF de fluorophores sensibles au pH. Il produira également automatiquement des caractéristiques de l’exocytose telles que la distribution spatiale ou la fréquence, ainsi que des propriétés individuelles d’événements exocytaires, telles que la demi-vie ou le changement de fluorescence sur le fond. En outre, une option est incluse pour classer les événements exocytaires en quatre modes d’exocytose, précédemment décrits dans la littérature.
Afin d’utiliser le logiciel de détection et d’analyse automatisées de l’exocytose, vous allez d’abord cliquer sur le bouton Rechercher un jeu de données, et vous allez naviguer jusqu’à l’endroit où vos données sont déposées, et vous voudrez mettre dans un dossier appelé données brutes. Vos fichiers de données rempliront automatiquement la liste ici, et vous pouvez avoir n’importe quel nombre de fichiers de données dans ce dossier. Ensuite, vous voudrez choisir un répertoire pour lequel vos fichiers d’analyse seront déposés.
Ici, j’ai choisi un répertoire appelé test. Vous voudrez également remplir la fréquence d’images de vos images ainsi que la taille des pixels. Ici, mes fréquences d’images sont de cent millisecondes par image, ma taille de pixel est de huit nanomètres.
Enfin, vous aurez besoin de fichiers de masque pour exécuter le logiciel de détection et d’analyse automatisées de l’exocytose. Vous pouvez utiliser le bouton de création de masque inclus afin de générer automatiquement des fichiers de masque à partir de vos fichiers de données. L’indicateur de course jaunit, puis redevient vert lorsque le fabricant de masques a fini de fonctionner.
Votre masque sera déposé dans un nouveau dossier appelé fichiers de masque dans le répertoire de votre choix. Et notez que les fichiers de masque rempliront automatiquement la liste ici. Vous voudrez vérifier que vos fichiers de masque sont correctement conçus pour vos fichiers de données, et vous pouvez le faire en mettant en surbrillance l’un des fichiers de données de la liste, ainsi que le fichier de masque correspondant.
La première image de votre fichier de données apparaîtra et le fichier de masque sélectionné apparaîtra également. Ici. Nous pouvons voir que nos fichiers de masque sont appropriés pour l’analyse en cours. Les fichiers de masque peuvent également être fournis séparément par l’utilisateur.
Lorsque l’on souhaite créer un fichier de masque à partir d’un fichier de données actuel, nous vous recommandons d’utiliser Image J.In pour ce faire, ouvrez d’abord l’image dans Image J à partir de laquelle vous souhaitez créer un fichier de masque. Vous pouvez ensuite utiliser l’outil de sélection de polygones pour commencer à créer un fichier de masque en cliquant autour du bord de la cellule. Lorsque vous avez terminé votre masque, double-cliquez pour vous connecter à l’ensemble du polygone.
Une fois cela terminé, vous vous dirigerez vers l’édition, la sélection et la création du masque. Un masque inversé sera créé. Vous souhaiterez enregistrer ce fichier de masque en utilisant le même nom que le fichier de données suivi de _mask_file.
Maintenant, si vous fournissez vos propres fichiers de masque personnalisés, il est important de faire savoir au logiciel de détection automatisée où se trouvent ces fichiers de masque. Pour ce faire, vous cliquerez sur le bouton Rechercher les fichiers de masque et accéderez au répertoire dans lequel se trouvent vos fichiers de masque. Les nouveaux fichiers de masque rempliront ensuite la liste ici.
Il est important que vous disposiez d’un masque pour chaque fichier de données avant que l’analyse puisse être exécutée. Maintenant, une fois que vous avez chargé votre jeu de données, vos fichiers de masque, votre fréquence d’images et votre taille de pixel ajustés correctement, et un répertoire choisi, vous pouvez enfin décider si vous souhaitez inclure la classification dans votre analyse. Si vous basculez le bouton de classification, en plus de détecter les événements exocytaires, chaque événement exocytaire sera classé dans l’une des quatre classes.
Une fois que vous avez décidé de la manière dont votre analyse doit être exécutée, vous pouvez commencer l’analyse en cliquant sur le bouton d’analyse. L’indicateur d’exécution devient jaune pour indiquer que l’analyse est en cours et redevient vert lorsque votre analyse est terminée. Une fois l’analyse terminée, comme indiqué par votre indicateur d’exécution passant du jaune au vert, vous remarquerez qu’un nouveau dossier de fichiers de données est apparu dans le répertoire de votre choix.
Dans le dossier des fichiers de données, vous trouverez des fichiers d’analyse correspondant à chaque ensemble d’images de votre exécution d’analyse. De plus, un fichier de statistiques cellulaires contenant des informations sommaires telles que la fréquence de l’exocytose pour chacun des ensembles d’images est ici. Pour chaque ensemble d’images, vous disposez d’un fichier de traces fluorescentes, qui contient des informations sur la position X, la position Y et le numéro d’image pour l’endroit où les événements exocytaires se produisent.
De plus, la fluorescence moyenne dans une région d’intérêt autour de chaque événement exocytaire est présentée avant, pendant et après l’exocytose. En outre, il existe également un fichier de suivi, qui contient des informations similaires sur les positions X, Y et temporelles. Cependant, si la case de classification est cochée, en outre, il y aura quatre colonnes supplémentaires, qui indiquent la probabilité que l’événement exocytaire appartienne à l’une des quatre classes.
Soit fusion de vésicules complète instantanée, fusion complète de vésicules retardée, baiser et courir instantanément, ou baiser et courir retardé. Un événement exocytaire appartient à l’une des quatre classes s’il est supérieur à 0,5 et est la probabilité la plus élevée au sein des quatre classes gouvernées. Dans ce cas, le premier événement exocytaire ici appartient à la classe instantanée de fusion de vésicules complète, car c’est le nombre le plus élevé au-dessus des quatre classes et il est supérieur à 0,5.
En outre, il existe un certain nombre d’autres fichiers de caractéristiques pour chaque ensemble d’images, qui sont utilisés lors de la classification de l’exocytose et peuvent être intéressants pour une analyse plus approfondie. Enfin, si nous voulons utiliser l’analyse K de Ripley afin de détecter l’organisation spatio-temporelle de l’exocytose, nous allons d’abord commencer par diviser notre fichier de masque en un fichier de masque de neurite et un fichier de masque de soma. Nous allons le faire en ouvrant d’abord notre masque dans Image J.Nous voudrons utiliser le sélecteur de couleurs afin de sélectionner un pixel d’arrière-plan.
Et de cette façon, lorsque nous remplissons le fichier de masque, c’est la valeur correcte. Ensuite, nous utiliserons l’outil de sélection de polygones et décrirons la région somatique. Maintenant, cela nécessite un peu de prise de décision subjective et manuelle.
nous suggérons un ellipsoïde rugueux. Une fois que vous avez terminé cela, vous allez ensuite éditer, sélectionner et créer un masque. Enfin, vous revenez à notre fichier de masque d’origine et utilisez l’édition et le remplissage afin de remplir le soma, et maintenant nous avons un fichier de masque neurite et soma séparé, que vous enregistrerez ensuite.
Une fois que vous avez enregistré votre fichier de masque neurite et soma séparé, ici, je l’ai en tant que fichier de masque underscore neur pour neurite et underscores soma, nous allons venir à MATLAB et ouvrir le fichier MATLAB du réseau neurite 2D. Ici, nous allons naviguer dans le dossier actuel jusqu’à notre répertoire où nous avons déposé toutes nos données d’analyse. Une fois que nous avons fait cela, nous aurons alors changé le chemin du nom du masque en notre nouveau fichier de masque qui est le neurite.
Donc, dans ce cas, j’ai mon fichier de masque neurite sous le dossier des fichiers de masque. Nous allons ensuite changer le nom du fichier CSV à l’endroit où se trouve notre fichier de traces fluorescentes. Dans ce cas, il est toujours dans le dossier des fichiers de données, et donc les fichiers de données slash et le nom du fichier CSV de traces fluorescentes.
Une fois que cela a été terminé, vous pouvez ensuite appuyer sur run. Cela créera ensuite une version squelettée du fichier de masque de neurite et le déposera en tant que fichier CSV dans le dossier des fichiers de masque, que nous pouvons voir ici. Ensuite, nous allons également générer un fichier CSV pour le soma.
Pour ce faire, ouvrez le fichier créateur de masque CSV. Vous voudrez mettre le chemin d’accès de votre masque soma et un nom pour le fichier CSV à créer. Ici, je viens d’aller de l’avant et d’utiliser le même nom de fichier exact, juste avec un point CSV ajouté.
Appuyez sur Run, et vous verrez qu’un nouveau fichier CSV soma a été créé à côté de la neurite. Une fois que nous avons créé les fichiers CSV pour le masque de neurite et le masque de soma, nous pouvons exécuter l’analyse K de Ripley. Pour ce faire, nous allons naviguer jusqu’à R Studio et ouvrir le fichier R d’analyse K de Ripley.
Il y a deux variables principales aux prises en compte, le masque neuronal et les points de données neuronales. Le masque neuronique pointera vers les fichiers de masque que vous souhaitez exécuter. Dans ce cas, j’exécute d’abord les fichiers de masque soma.
Vous voudrez exécuter tous vos fichiers de masque soma séparément de tous vos fichiers de masque neurite. Ici, j’ai deux neurones, que je vais utiliser pour cette analyse. Cependant, vous pouvez en utiliser autant que vous le souhaitez pour l’analyse K de Ripley, vous voudrez simplement copier et coller ce code pour le masque de neurone et changer la variable à trois, et au-delà.
La deuxième variable est les points de données neuronales. Ici, vous voulez le pointer vers le fichier qui a été généré par vos fonctionnalités tous les fichiers R extraits. Maintenant, le mien s’appelait fusion stats, et c’est donc ce qu’il lit ici.
Comme mentionné, j’ai un deuxième fichier de masque de soma et un neurone, qui est en cours d’analyse à côté afin que nous puissions agréger le K de Ripley ensemble. Une fois que vous avez modifié ces chemins d’accès au chemin d’accès correct, vous utiliserez du code, exécuterez la région et exécuterez tout. Une fois l’exécution terminée, plusieurs tracés seront générés, y compris les valeurs K de Ripley groupées, ainsi que les diagrammes de densité.
Ceux-ci peuvent être enregistrés en allant exporter, enregistrer l’image sous et en choisissant le format d’image approprié, le répertoire, le nom de fichier, et enfin en appuyant sur Enregistrer. Nous voyons ici des résultats représentatifs de 12 neurones corticaux murins exprimant l’évent en fluor imagés à deux jours in vitro en utilisant la microscopie TIRF. Dans A, nous voyons la fréquence de l’exocytose divisée par classe.
Ici, nous pouvons voir que la fusion complète des vésicules instantanée se produit plus fréquemment que les autres classes. Dans B, nous pouvons voir la distribution du mode, confirmant que la fusion instantanée complète des vésicules représente plus de la moitié de tous les événements. En C, nous déterminons la distribution spatiale de l’exocytose sous forme de carte thermique.
Nous pouvons voir que la majorité des événements exocytaires sont regroupés dans un point chaud près du soma, ainsi qu’aux extrémités distales des neurites. En D, nous pouvons déterminer que les événements exocytaires sont statistiquement regroupés de manière significative et que la taille de ces amas varie d’un demi-micron à un micron. L’utilisation d’un programme d’analyse automatisé pour identifier et analyser correctement les événements exocytaires de manière impartiale augmente l’efficacité de l’analyse et améliore la reproductibilité et la rigueur.
Pour assurer la précision de la détection, il est important de maintenir un signal élevé au bruit pendant l’imagerie. La capture d’événements exocytaires ou d’autres événements transitoires sensibles au pH nécessite une fréquence d’imagerie suffisamment rapide pour capturer tous les événements et améliorer les estimations telles que la demi-vie ou le changement de pic de fluorescence. Nous avons démontré que non seulement ce programme fonctionne pour capturer avec précision la fluorescence sensible au pH dans les neurones en développement, mais aussi d’autres types de cellules.
Toutefois, si vous utilisez un autre type de cellule, il est important de vérifier les différences de précision, en raison des comportements distincts des événements transitoires dans d’autres types de cellules. Cette classification n’a été utilisée que dans le développement des neurones à ce jour. Et en effet, nous ne savons pas que ces processus existent dans d’autres types de cellules ou à des moments de développement ultérieurs dans les neurones.
