Eksositoz Yazılımının Otomatik Algılayışı ve Analizi, kullanıcının pH'a duyarlı floroforların eksosit olaylarını ve TIRF görüntü dizilerini otomatik olarak algılamasını sağlayacaktır. Ayrıca, mekansal dağılım veya frekans gibi eksositozun özelliklerinin yanı sıra, arka plan üzerindeki yarı ömür veya floresan değişikliği gibi eksositotik olayların bireysel özelliklerini otomatik olarak çıkacaktır. Ek olarak, eksositozis olayları daha önce literatürde açıklanan dört eksositoz moduna sınıflandırmak için bir seçenek dahildir.
Exocytosis yazılımının Otomatik Algılanmasını ve Analizini kullanmak için önce veri kümesini bul düğmesine tıklayacak ve verilerinizin nereye yatırıldığına gidecek ve ham veri adlı bir klasöre koymak isteyeceksiniz. Veri dosyalarınız listeyi burada otomatik olarak doldurur ve bu klasörde istediğiniz sayıda veri dosyası olabilir. Ardından, analiz dosyalarınızın yatırılacağı bir dizin seçmek isteyeceksiniz.
Burada test adında bir dizin seçtim. Ayrıca, resimlerinizin kare hızını ve piksel boyutunu doldurmak isteyeceksiniz. Burada kare hızlarım kare başına yüz milisaniye, piksel boyutum sekiz nanometre.
Son olarak, Exocytosis yazılımının Otomatik Algılanmasını ve Analizini çalıştırmak için maske dosyalarına ihtiyacınız olacaktır. Veri dosyalarınızdan otomatik olarak maske dosyaları oluşturmak için birlikte verilen maske üreticisi düğmesini kullanabilirsiniz. Maske üreticisinin çalışması tamamlandığında çalışma göstergesi sarıya döner ve sonra yeşile döner.
Maskeniz, seçtiğiniz dizindeki maske dosyaları adlı yeni bir klasöre yatırılır. Ve unutmayın, maske dosyaları listeyi otomatik olarak burada doldurur. Maske dosyalarınızın veri dosyalarınız için uygun şekilde yapıldığını kontrol etmek isteyeceksiniz ve bunu listedeki veri dosyalarından herhangi birini ve ilgili maske dosyasını vurgulayarak yapabilirsiniz.
Veri dosyanızın ilk karesi ve seçilen maske dosyası da görünecektir. Burada. Maske dosyalarımızın eldeki analiz için uygun olduğunu görebiliyoruz. Maske dosyaları kullanıcı tarafından ayrı olarak da sağlanabilir.
Geçerli bir veri dosyasından maske dosyası yapmak istediğinizde, bunu yapmak için Image J.In kullanmanızı öneririz, önce maske dosyası yapmak istediğiniz görüntüyü Image J'de açın. Daha sonra hücrenin kenarını tıklatarak etrafta bir maske dosyası oluşturmaya başlamak için çokgen seçim aracını kullanabilirsiniz. Maskenizi tamamladığınızda, çokgenin tamamına bağlanmak için çift tıklatın.
Bu tamamlandıktan sonra, düzenlemeye, seçmeye ve maske oluşturmaya başlayacaksınız. Ters çevrilmiş bir maske oluşturulacak. Bu maske dosyasını, veri dosyasıyla aynı adı kullanarak ve ardından _mask_file.
Şimdi, kendi özel maske dosyalarınızı sağlarsanız, otomatik algılama yazılımının bu maske dosyalarının nerede olduğunu bilmesini sağlamak önemlidir. Bunu yapmak için maske dosyalarını bul düğmesini tıklatacak ve içinde maske dosyalarınız olan dizine gideceksiniz. Yeni maske dosyaları daha sonra listeyi burada doldurur.
Çözümleme çalıştırılmadan önce her bir veri dosyası için bir maskeniz olması önemlidir. Şimdi, veri kümenizi yükledikten, maske dosyalarınızı, kare hızınızı ve piksel boyutunuzu doğru ayarladıktan ve seçilen bir dizini yükledikten sonra, analizinizin bir parçası olarak sınıflandırma eklemek isteyip istemediğinize sonunda karar verebilirsiniz. Sınıflandırma düğmesini değiştirdiğinizde, eksosit olayları algılamanın yanı sıra, her eksosit olay dört sınıftan birinde sınıflandırılır.
Analizinizin nasıl yürütülebileceğine karar verdikten sonra, analiz düğmesine tıklayarak analize başlayabilirsiniz. Çalıştırma göstergesi, analizin devam ettiğini belirtmek için sarıya döner ve analiziniz tamamlandığında yeşile döner. Analiz tamamlandıktan sonra, çalışma göstergenizin sarıdan yeşile değişmesiyle belirtildiği gibi, seçtiğiniz dizinde yeni bir veri dosyaları klasörünün göründüğünü fark edeceksiniz.
Veri dosyaları klasöründe, analiz çalıştırmanızda ayarlanan her görüntüye karşılık gelen analiz dosyalarını bulacaksınız. Ek olarak, görüntü kümelerinin her biri için eksositoz sıklığı gibi özet bilgileri içeren bir hücre istatistik dosyası buradadır. Her görüntü kümesi için, dış olayların meydana geldiği yer için X konumu, Y konumu ve çerçeve numarası hakkında bilgi içeren bir floresan izleme dosyanız vardır.
Ek olarak, her eksositoz olayının etrafındaki ilgi çekici bir bölgedeki ortalama floresan hem eksositoz öncesi, hem de sırasında ve sonrasında sunulur. Buna ek olarak, X, Y ve zamansal pozisyonların benzer bilgilerini içeren bir izleme dosyası da vardır. Ancak, sınıflandırma onay kutusu işaretlenirse, ayrıca, dört sınıftan birine ait eksosit olayının olasılığını gösteren dört ek sütun olacaktır.
Ya tam vesicle füzyonu anlık, tam vezikli füzyon gecikmeli, öp ve çalıştır anında ya da öp ve koş gecikmeli. Eksosit olay, 0,5'ten büyükse ve yönetilen dört sınıf içindeki en yüksek olasılıksa, dört sınıftan birine aittir. Bu durumda, buradaki ilk ekzositik olay, dört sınıfın üzerindeki en yüksek sayı olduğu ve 0,5'ten büyük olduğu için tam vesicle fusion instantaneous sınıfına aittir.
Ek olarak, her görüntü seti için eksositoz sınıflandırması sırasında kullanılan ve daha fazla analiz için ilgi çekici olabilecek bir dizi başka özellik dosyası vardır. Son olarak, eksositozun mekansal-zamansal organizasyonunu tespit etmek için Ripley'in K analizini kullanmak istiyorsak, ilk olarak maske dosyamızı neurite bir maske dosyasına ve soma maske dosyasına bölerek başlayacağız. Bunu ilk olarak Image J.'de maskemizi açarak yapacağız Bir arka plan pikseli seçmek için renk seçiciyi kullanmak isteyeceğiz.
Ve bu şekilde, maske dosyasını doldurduğunuzda, doğru değerdir. Daha sonra çokgen seçim aracını kullanacağız ve somatik bölgeyi özetleyeceğiz. Şimdi bu biraz öznel, manuel karar verme gerektiriyor.
Kaba bir elipsoid öneriyoruz. Bunu tamamladıktan sonra düzenlemeye, seçmeye ve maske oluşturmaya gideceksiniz. Son olarak, orijinal maske dosyamıza geri gelecek ve soma doldurmak için düzenleme ve doldurmayı kullanacaksınız ve şimdi daha sonra kaydedeceğiniz ayrı bir neurite ve soma maske dosyamız var.
Ayrı neurite ve soma maske dosyanızı kaydettikten sonra, burada, neurite için maske dosyası alt çizgi neur olarak var ve soma'nın altını çiziyor, MATLAB'a geleceğiz ve neurite 2D ağ MATLAB dosyasını açacağız. Burada, mevcut klasörde tüm analiz verilerimizi yatırdığımız dizine yönlendireceğiz. Bunu yaptıktan sonra, maske adı yolunu neurite olan yeni maske dosyamıza değiştirmiş olacağız.
Bu durumda, maske dosyaları klasörünün altında neurite maske dosyam var. Daha sonra CSV dosya adını floresan izleme dosyamızın bulunduğu yere değiştireceğiz. Bu durumda, hala veri dosyaları klasöründedir ve bu nedenle veri dosyaları eğik çizgi ve floresan adı CSV dosyasını izler.
Bu tamamlandıktan sonra, çalıştır tuşuna basabilirsiniz. Bu daha sonra neurite maske dosyasının iskeletleştirilmiş bir sürümünü oluşturacak ve burada görebildiğimiz maske dosyaları klasörünün altına bir CSV dosyası olarak yatıracaktır. Daha sonra soma için de bir CSV dosyası oluşturacağız.
Bunu yapmak için CSV maske oluşturucu dosyasını açın. Soma maskeniz ve oluşturulacak CSV dosyası için bir ad için yola koymak isteyeceksiniz. Burada sadece devam ettim ve aynı dosya adını kullandım, sadece nokta CSV eklenmiş olarak.
Çalıştır'a bastığınızda, neurite ile birlikte yeni bir soma CSV dosyasının oluşturulduğunu göreceksiniz. Hem neurite maskesi hem de soma maskesi için CSV dosyalarını oluşturduktan sonra Ripley'in K analizini yapabiliriz. Bunu yapmak için R Studio'ya gideceğiz ve Ripley'in K analiz R dosyasını açacağız.
Burada dikkat etmesi gereken iki ana değişken vardır: nöron maskesi ve nöron veri noktaları. Nöron maskesi, çalıştırmak istediğiniz maske dosyalarını gösterecektir. Bu durumda, ilk olarak soma maske dosyalarını çalıştırıyorum.
Tüm soma maske dosyalarınızı tüm neurite maske dosyalarınızdan ayrı olarak çalıştırmak isteyeceksiniz. Burada, bu analiz için kullan olacağım iki nöron var. Ancak, Ripley'in K analizi için istediğiniz kadar kullanabilirsiniz, sadece nöron maskesi için bu kodu kopyalayıp yapıştırmak ve değişkeni üçe ve ileriye doğru değiştirmek isteyeceksiniz.
İkinci değişken nöron veri noktalarıdır. Burada, tüm ayıklanmış R dosyanızın özellikleri tarafından oluşturulan dosyaya işaret etmek istiyorsunuz. Şimdi benimkine füzyon istatistikleri adı verildi.
Belirtildiği gibi, ripley'in K'sını bir araya getirebilmemiz için birlikte analiz edilen ikinci bir soma maske dosyam ve nöronum var. Bu yolları doğru yol olarak değiştirdikten sonra, kod kullanacak, bölgeyi çalıştıracak ve tüm yolları çalıştıracaksınız. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, gruplanmış Ripley'in K değerlerinin yanı sıra yoğunluk çizimleri de dahil olmak üzere çeşitli çizimler oluşturulacaktır.
Bunlar dışa aktarmaya giderek, görüntüyü farklı kaydederek ve uygun görüntü biçimini, dizini, dosya adını seçerek ve son olarak kaydet tuşuna basarak kaydedilebilir. Burada, TIRF mikroskopisi kullanılarak iki günlük in vitro olarak görüntülenmiş flora havalandırmayı ifade eden 12 murine kortikal nörondan temsili sonuçlar görüyoruz. A'da eksositoz sıklığını sınıfa göre ikiye böldüğünü görüyoruz.
Burada tam vesicle füzyon an öncesinin diğer sınıflara göre daha sık meydana geldiğini görebiliriz. B'de, tam vezne füzyonunun tüm olayların yarısından fazlasını oluşturan modun dağılımını görebiliriz. C'de eksositozun mekansal dağılımını bir ısı haritası olarak belirleriz.
Ekzosit olayların çoğunun soma yakınlarındaki bir sıcak noktada ve nötrotların distal uçlarında kümelendiğini görebiliriz. D'de eksosit olayların istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde kümelendiğini ve bu kümelerin boyutunun yarım mikrondan bir mikrona kadar değiştiğini belirleyebiliriz. Eksosit olayları tarafsız bir şekilde doğru bir şekilde tanımlamak ve analiz etmek için otomatik bir analiz programının kullanılması analiz verimliliğini arttırır ve tekrarlanabilirliği ve titizliği artırır.
Algılamanın doğruluğunu sağlamak için, görüntüleme sırasında gürültüye karşı yüksek bir sinyal sağlamak önemlidir. Eksosit olayları veya diğer pH'a duyarlı geçici olayları yakalamak, tüm olayları yakalamak ve floresandaki yarı ömür veya tepe değişimi gibi tahminleri iyileştirmek için yeterince hızlı bir görüntüleme frekansı gerektirir. Bu programın sadece gelişmekte olan nöronlarda pH'a duyarlı floresan yakalamak için değil, aynı zamanda diğer hücre tiplerinde de işe yaradığını gösterdik.
Ancak, başka bir hücre türü kullanıyorsanız, diğer hücre türlerindeki geçici olayların farklı davranışları nedeniyle doğruluk farklılıklarını kontrol etmek önemlidir. Bu sınıflandırma bugüne kadar sadece nöronların geliştirilmesinde kullanılmıştır. Ve gerçekten de bu süreçlerin diğer hücre tiplerinde veya nöronlarda daha sonraki gelişimsel zaman noktalarında var olduğunu bilmiyoruz.
