Katılımcılar çocuk Onkoloji grubu AAML1531 çalışma ve hemşirelerin sağlık eğitim hasta numuneleri şeklinde katkılarından dolayı teşekkür ediyoruz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri (UM1 CA186107, RO1 CA49449 ve RO1 CA149445), çocukların Discovery Enstitüsü Washington Üniversitesi ve St. Louis Çocuk Hastanesi (MC-II-2015-461) ve Eli Seth Matthews Lösemi Vakfı tarafından finanse edildi.

<ol>
	<li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li><li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations.">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li><li>Young, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ultra-rare+pre-leukemic+clones+via+targeted+error-corrected+sequencing.">Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing.</a> Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> NatureCommunications. 7, 12484 (2016).</li><li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia.">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li><li>Kohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+residual+disease+by+next-generation+deep-sequencing+of+RUNX1+mutations+can+identify+acute+myeloid+leukemia+patients+with+resistant+disease.">Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease.</a> Leukemia. 28, 129-137 (2014).</li><li>Luthra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing-based+multigene+mutational+screening+for+acute+myeloid+leukemia+using+MiSeq:+applicability+for+diagnostics+and+disease+monitoring.">Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring.</a> Haematologica. 99, 465-473 (2014).</li><li>Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+rare+mutations+with+massively+parallel+sequencing.">Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).</li><li>Schmitt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing.">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).</li><li>Vander Heiden, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pRESTO:+a+toolkit+for+processing+high-throughput+sequencing+raw+reads+of+lymphocyte+receptor+repertoires.">pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires.</a> Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA.">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).</li><li>Shugay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGERI:+Computational+pipeline+for+molecular-barcoded+targeted+resequencing.">MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing.</a> PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480 (2017).</li><li>Wong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia.">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li><li>Krimmel, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-deep+sequencing+detects+ovarian+cancer+cells+in+peritoneal+fluid+and+reveals+somatic+TP53+mutations+in+noncancerous+tissues.">Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).</li><li>Phallen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+early-stage+cancers+using+circulating+tumor+DNA.">Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA.</a> ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415 (2017).</li><li>Egorov, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers.">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, biz mutasyonlar farklı hastalıklarda düşük VAFs ile çalışmaya kolayca uygulanabilir sıralama hatası düzeltildi protokol paketi olan göstermek. Hata düzeltme, ham okuma seçeneğini etkinleştirin UMIs birleşme sıralama önce her molekül ile en önemli faktör olduğunu. Yöntem tanımlamak burada araştırmacılar için piyasada bulunan gen panelleri ve kendi kendine tasarlanmış gene özgü oligos özelleştirilmiş UMIs dahil etmek izin verir.
Standart NGS protokol nedeniyle sıralama hata oranı % 2'in altında VAF ile mutasyonlar algılanmasını önler ve bu NGS uygulama nadir türevleri algılanması çok önemli nerede çalışmalarda sınırlar. Standart NGS hata oranı engellemeyi tarafından ECS hassas bu ham çeşitleri tespiti sağlar. Örneğin, Bu mutasyonlar ilk (Bu nedenle düşük VAF sahip) ortaya çıkan zaman patojenik mutasyon tespiti hastalığı14,15erken müdahale bilgi vermeleri zorunludur. Lösemi araştırma, çok az kalıntı tespiti hastalığı (rezidüel lösemi hücreleri tedavi sonrası) risk stratifikasyon bilgilendirir ve tedavi seçenekleri ikili akış sitometrik değerlendirmeler cant bir şekilde bilgilendirmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, ECS dolaşımdaki tümör nükleik asit algılamaya ve varlığı/olmaması için hem de birincil özellikleridir belirli mutasyonların varyant yük değerlendirmek tarafından solid tümör hastalarda metastatik potansiyeli değerlendirmek için geçerlidir tümör16.
Tablo 1' de gösterildiği gibi türevlerini aramak için konum özgü hata binom dağılımı tabanlı modeli kullanarak güç büyük ölçüde sıralı kitaplıkları sayısı gibi yanı sıra hata model oluşturmak için kullanılan sıralama derinliği bağlıdır. Hata modeli sağlamlık daha yüksek sayıda örnekleri ve daha fazla sıralama derinliği artar. Her örnek için bir hata profili oluşturmak için Ortalama hata düzeltilmiş örnek başına 3000 x okuma kapsamını ile en az 10 sıralı örnekleri kullanmak için tavsiye edilir. Pozisyon özel yaklaşım benzer MAGERI, ancak tüm altı farklı ikame türler için bir toplama hata oranı kullanarak yerine (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, her konumda bağımsız olarak her ikame modeli. Örneğin, bir hata oranı c > T belirli bir genomik pozisyonda başka bir konumdan farklı. Gibi bir sıralama vadede gözlenen temel ikame oranı çalıştırmak diğerinden farklı olabilir bizim yaklaşım bir sıralama toplu etkisi de dikkate alır. Bu nedenle özellikle farklı sıralama çalıştırır örnekleri model oluşturmak için havuza zaman her pozisyon için tüm yerine koyma türleri modellemek önemlidir.
Ne zaman bir ECS deney tasarımı önemli bir göz istediğiniz algılama eşik var. NGS çalışmaların onlar kolayca genler/hedefleri açısından faiz, algılama eşiği (sıralama derinliği tarafından dikte) ve sorgulanan sayisi ölçeklendirilebilir güzelliktir. Araştırmacılar 0,0001 bir algılama eşiği ile iki amplicons nadir mutasyonlar bulmak istiyorsanız, örneğin, onlar sonuna kadar 75 örnekleri 15 milyon okuma çıkarır MiSeq V2 Kimya'yı kullanarak çalışacak tek bir sıralama havuz (2 amplicons * 10.000 molekülleri * 10 okur hata düzeltme için * 75 örnekleri 15 milyon sıralama okuma =). Araştırmacılar, sıralama veya algılama eşik ayarlamak için çalıştırmak tek bir sıralama içinde havuza alınan örnek sayısına içine gidip moleküllerin bu sayı değişebilir. Çalışmalarımız, biz 0.0001 VAF (1:10, 000) ile bir algılama eşiği mutasyonlar bulmaya yönelik Illumina gen panelini kullanarak. Biz düzenli olarak 250 kullanmak yeterli molekülleri yukarıda belirtilen algılama eşik ulaşmak için yakalanır emin olmak için DNA başlatma ng. Araştırmacılar daha düşük miktarda DNA ile başlatmak için tercih (50 ng önerilir) istenen algılama sınırı ise > 0,001 VAF.
UMIs i5 dizinler eklenir gibi sıralama ayarları buna göre değiştirilmesi gerekir. Örneğin, 16 N UMIs kullandık ve sıralama ayarlarını 2 x 144 eşleştirilmiş son okuma, Dizin 1 8 döngüleri ve 16 döngüleri dizin 2 dizin 2 her zamanki 8 döngüleri karşı vardı. Dizin 2 döngüsü artış döngüsü okur için ayrılan toplam sayısı bir düşüş eşitlenmektedir. Araştırmacılar 12N UMIs10,17kullanmayı seçerseniz, dizin 2 12 döngüleri ayarlarının değiştirilmesi gerekir.
Bu UMI tabanlı sıralama yöntemi sıralama hatalarını düzeltmek için optimize edilmiştir. Suboptimal PCR jackpotting ile ilgili olan tüm amplifikasyon tabanlı yöntemi için bir sorun olduğunu kalır. Biz sonrası sıralama ve post-Biyoinformatik doğrulama ddPCR kullanarak gerçekleştirilen ve neredeyse herhangi bir yanlış pozitif PCR jackpotting nedeniyle tespit. Bununla birlikte, araştırmacılar düşük amplifikasyon hataları emin olmak için yüksek sadakat polimeraz kullanarak deneyler yapmak önerilir.

Biz yaş, mutajen ve somatik aberasyonları genom ve bu birikimi sonucunda hücre bölünmesi sırasında Stokastik hataları maruz altında yatan malign transformasyon, temel patogenezinde nöro-gelişimsel hastalıkları, pediyatrik bozuklukları ve normal yaşlanma1,2. Somatik mutasyon hastalık sürüş potansiyeli olan erken teşhis ve risk yönetimi3,4,5önemli tanılama ve prognostik biyolojik vardır. Fizyolojik clonogenesis daha iyi anlamak için hangi klinik bilgilendirmek ve kararları, doğru miktar ve bu mutasyonlar karakterizasyonu araştırma birincil önem taşımaktadır. Yeni nesil sıralama (NGS) Şu anda türdeş olmayan DNA örnekleri klonal mutasyonların incelemek için kullanılır; Ancak, NGS mutasyonlar, belirlenmesi için sınırlıdır > 0,02 varyant alleli kesir (VAF) — nedeniyle 0.5-2.0 içsel hata oranını % sıralama platformları6,7,8. Sonuç olarak, takip eden ve prognostically önemli somatik değişik alt VAF adlı standart NGS kullanarak elde edilemez.
Son zamanlarda, hata oranı NGS8,9,10,11aşmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemleri kullanmak moleküler etiketleme, hata düzeltme sonra sıralama sağlar. Her molekül veya sıralama kitaplığı'genomik parça ile bir rasgele benzersiz moleküler tanımlayıcı (Bu molekül özgü UMI) etiketlenir. UMIs bir dizi randomize nükleotit (8-16 H) permütasyon tarafından inşa edilir. İkinci bir örnek özgü barkod Ayrıca birden fazla örnekleri çalıştırmak aynı NGS sıralama içine çoğullama sağlar iş akışı içine entegre edilmiştir. PCR güçlendirme tatlı öğesini Kütüphane üzerinde gerçekleştirilir ve daha sonra kütüphane sıralama için gönderilir. Kütüphane hazırlık sırasında bu hata rastgele genomik parçası PCR güçlendirme ve sıralama8sırasında tanıtılacaktır bekleniyor. Rasgele sıralama hatalarını kaldırmak için ham sıralama okuma UMI göre gruplandırılır. Sıralama yapılardan ise gerçek bir değişken sadakatle güçlendirilmiş ve aynı UMI paylaşan tüm okur sıralı konumunda aynı genomik Stokastik olması nedeniyle giriş, aynı UMI ile tüm okuma bulunması beklenen değil. Eserleri kaldırıldı bioinformatically vardır. Burada, biz üç yöntem, hata düzeltilmiş sıralama (Laboratuvar tek nükleotid türevleri (SNVs) ve küçük ekleme-silme (Indels) tanımlamak DNA ve RNA gen ifade aşağıdaki miktar kolaylaştırmak en iyi duruma getirilmiş ECS) tarif NGS hata eşiği.
İlk yöntem nadir somatik olay araştırmacılar tarafından tasarlanmış gen belirli primerler kullanılarak aramak için bir yol anlatılmaktadır. Kütüphane hazırlık önce araştırmacılar faiz parçaları hedeflemek için astar tasarlamalısınız. Biz web-app Primer3 kullanılan (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). UMIs dahil edilmiştir bir kez bunlar olacak gibi Amplicons 200-250 BP polimeraz zincir tepkimesi (PCR) için ideal, eşleştirilmiş uç okuma 150 bp eşleştirilmiş uç okuma ile örtüşen oluşturmak. Kullanılacak en uygun astar tasarım koşullar: en az astar boyutu = 19; En uygun astar boyutu = 25; Maksimum astar boyutu = 30; En az Tm = 64 ° C; Optimum Tm = 70 ° C; Maksimum Tm = 74 ° C; En fazla Tm farkı = 5 ° C; En az GC içerik = 45; Maksimum GC oranı = 80; Dönmek için sayı = 20; En fazla 3' sonunda istikrar = 100.
Yöntem 2'de, Illumina Kimya klonal SNVs ve küçük Indels gibi amplicons yüzlerce içerir ticari olarak mevcut Gen panellerini kullanarak 0.0001 VAF nadir için anket için ECS-DNA Protokolü birleştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Biz TruSight Myeloid sıralama paneli (Illumina) bizim deneme için kullanılan ve genişletilmiş bir masası çocuk miyeloid hastalıkları için ilgi ek genler dahil etmek için tasarlanmış. Bu paneller biz bu paneller için bağdaştırıcı stratejimiz ekledik böylece hata düzeltme, kolaylaştırmak moleküler benzersiz tanımlayıcıları (UMIs) teklif değil. ECS-meli iş herhangi bir farklı hastalıklar ile ilişkili genler için zenginleştirmek için tasarlanmış diğer paneller ile eşit derecede iyi. DNA izolasyon ve sonraki miktar doku veya örnek ilgi önerilir en az 500 için ng stok numune DNA. Biz düzenli olarak 250 kullanarak bir tek sıralama kitaplığı yapmak için mümkün olduğunca çok benzersiz genomik parçası olarak aşağı yakalamak için DNA'ın ng okur de-çoğaltma ve VAF hesaplama. Bir isteğe bağlı çoğaltma sıralama kitaplığı kalan 250 ile yapılan DNA'ın ng. Biz her zaman örnek başına iki Çoğalt kitaplık yapmak ve biz bağımsız olarak her iki çoğaltır gerçek pozitif olarak tespit olayları düşünün. Ayrıca değişken4,13arama doğruluğunu artırmak için genomik pozisyon özgü binom hata modeli uygulanır.
Son olarak, biz kapalı QIAseq hedef RNA panelleri (QIAGEN) kullanarak transkript miktar için RNA sıralama için ECS kaplin bir yöntem açıklanmaktadır. UMIs de-çoğaltma için gerekli ve hata düzeltme kitleri dahil ve araştırmacılar kitaplıkları üreticinin önerilerini takip yapabilirsiniz. Bioinformatically, araştırmacılar Protokolü bölümünde ayrıntılı olarak açıklanacaktır ECS-DNA için özetlenen boru hattı takip edebilirsiniz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-130-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI i5 adapter sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7442S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7595S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSight Myeloid Sequencing Panel</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-130-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie 2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized QIAseq Targeted RNA Panel</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plus Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rare event detection using error-corrected dna and rna sequencing

Geleneksel yeni nesil sıralama teknikleri (NGS) için bir on yıl içinde muazzam genomik karakterizasyonu için izin vermiş. Özellikle, NGS klonal mutasyonlar spektrum malignite çözümlemek için kullanılan. Yine de çok daha verimli geleneksel Sanger yöntemleri, nadir klonal ve subclonal mutasyonlarının ~0.5–2.0 oranında onun yüksek hata nedeniyle belirlenmesi ile NGS mücadele daha. Böylece, standart NGS algılaması olan mutasyonlar için bir sınırı vardır > 0,02 varyant alleli kesir (VAF). Bilinen hastalık belirsizdir olmadan artık hastalık olduğunda mutasyonlar bu hastalarda nadir için klinik önemi ise lösemi için tedavi edilen hastaların önemli ölçüde sonuçlar iyileştirilmiştir < 0,0001 akış sitometresi tarafından. NGS artefactual bu arka plan azaltmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Burada hata düzeltilmiş DNA ve RNA sıralama (hata düzeltme için 16 bp rasgele dizindeki ve çoğullama için 8 bp hastaya özgü dizin ile bireysel moleküllerin etiketleme içerir ECS), için bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim Yöntem algılamak ve varyant alleli kesirler (VAFs) iki büyüklük NGS algılama sınırı daha düşük ve 0.0001 VAF gibi nadir, klonal mutasyonlar izlemek.

Targeted Error-corrected sıralama ile DNA'ın, mutant hasta DNA ticari genomik DNA'sında sulandrarak prensibi deneyi bir kanıtı gerçekleştirdiniz. Hasta bir mutasyon GATA1 vardı (chrX:48650264, C > G) orijinal VAF 0.19 ile. Şekil 1 ' de ECS 1:10,000 tek nükleotid varyant için bir seviye için nicel olduğunu ispat.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> Şekil 1: ECS 1:10,000 seviyeye nicel GATA1 SNV gösteren seyreltme dizi. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Biz de ECS-DNA güvenilir içinde yetişkin akut miyeloid lösemi (AML) sağlıklı yaşlı bireylerin4yerleştirilmiştir genlerinde klonal mutasyonlar nadir algılar gösterir. Biz 20 sağlıklı bireyler hemşirenin sağlık kabaca ~ 10 yıl arayla banked çalışmada buffy ceket örnekleri aldı. Biz bu örnekler üzerinde ECS-DNA paneli iletişim kuralı uygulanır. Bu deneme için Illumina TruSight Myeloid sıralama 568 amplicons (https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html gen listesi hakkında daha fazla bilgi) oluşan Panel uyarlanmış ve sıralı 20 bireylerin 80 kitaplıkları (2 koleksiyon farklı zaman noktalarda bağımsız birim zamanda başına 2 çoğaltır işaret ederek) 47,7 milyon eşleştirilmiş uç okuma ortalama ve ortalama 3.4 milyon hata düzeltilmiş oluşturulan Illumina NextSeq platformu kullanarak her kütüphane4için fikir birliği serileri. Kütüphane başına ortalama nükleotit kapsama yaklaşık 6.000 x (3.4 milyon 568 tarafından bölünmüş) yapıldı. Her örnek için bir pozisyon özgü hata profil aynı örnekten olmayan sıralı kitaplıklarını kullanma inşa. En az bir koleksiyon zaman noktası her iki çoğaltır içinde mevcut 109 klonal somatik mutasyon bulduk. Bu mutasyonlar VAF 0,0003-0.1451 değişen var. Biz bilinen kozmik temsilcilikleri ile 21 mutasyonlar seçili ve ddPCR kullanarak bir ya da iki koleksiyon zaman noktalarının tüm 21 mutasyonların doğrulanmış (n = 34, Şekil 2, Genç ve ark. 20164den uyarlanmıştır).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> Şekil 2: ECS tarafından tanımlanan mutasyonlar ddPCR ile son derece uyumlu VAFs üzerinden doğrulanmadı. (n = 34, Genç ve ark. 20164modifiye). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
ECS-RNA protokolünü kullanarak hata düzeltilmiş ifade düzeyi ile ilgili çeşitli kanserler (QIAseq insan kanser Transcriptome Masası'ndan uyarlama) ve biz ile ilişkili olduğu bilinen 416 genler oluşur QIAseq kimya kullanarak bir gen panel özelleştirilmiş belirli bir gen ( ek malzeme 1gen listesinde) en sık ifade exon güçlendirilmiş. Biz Kütüphane ortalama 8.3 milyon okur verdi eşleştirilmiş uç biçiminde Illumina MiSeq platformu kullanarak kitaplıkları sıralı ve 0.417 milyon hata düzeltilmiş fikir birliği dizileri ortalama yakalamak başardı. Biz gösterdi ki düşük bereket transkript ifade düzeyini (< 1.000 transkript sayısı 50 ng toplam RNA) çoğaltır arasında son derece tekrarlanabilir (veri noktası n = 300, Şekil 3). DdPCR (ifade değişen ölçüde altı seçili genler) doğrulanması bu genlerin ifade düzeyini doğru şekilde normalleştirme için gerek kalmadan ECS protokolü tarafından ele geçirilen gösterdi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> Şekil 3: Top, transkript korelasyon sayar ECS-RNA tarafından aynı örnek çoğaltır arasında (n = 300). Alt, sayıları ECS tarafından tespit ddPCR tarafından doğrulanmadı transkript (n = 6). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing at JoVE.com

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

11.9K Görüntüleme.  Washington University School of Medicine. Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Video: Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...