Ringraziamo i partecipanti allo studio dei bambini AAML1531 del gruppo di oncologia e studio della salute degli infermieri per i loro contributi sotto forma di campioni dei pazienti. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health (UM1 CA186107, CA49449 RO1 e RO1 CA149445), Discovery Institute di Washington University dei bambini e St. Louis Children Hospital (MC-II-2015-461) ed Eli Seth Matthews leucemia Foundation.

<ol>
	<li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li><li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations.">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li><li>Young, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ultra-rare+pre-leukemic+clones+via+targeted+error-corrected+sequencing.">Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing.</a> Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> NatureCommunications. 7, 12484 (2016).</li><li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia.">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li><li>Kohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+residual+disease+by+next-generation+deep-sequencing+of+RUNX1+mutations+can+identify+acute+myeloid+leukemia+patients+with+resistant+disease.">Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease.</a> Leukemia. 28, 129-137 (2014).</li><li>Luthra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing-based+multigene+mutational+screening+for+acute+myeloid+leukemia+using+MiSeq:+applicability+for+diagnostics+and+disease+monitoring.">Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring.</a> Haematologica. 99, 465-473 (2014).</li><li>Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+rare+mutations+with+massively+parallel+sequencing.">Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).</li><li>Schmitt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing.">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).</li><li>Vander Heiden, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pRESTO:+a+toolkit+for+processing+high-throughput+sequencing+raw+reads+of+lymphocyte+receptor+repertoires.">pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires.</a> Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA.">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).</li><li>Shugay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGERI:+Computational+pipeline+for+molecular-barcoded+targeted+resequencing.">MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing.</a> PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480 (2017).</li><li>Wong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia.">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li><li>Krimmel, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-deep+sequencing+detects+ovarian+cancer+cells+in+peritoneal+fluid+and+reveals+somatic+TP53+mutations+in+noncancerous+tissues.">Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).</li><li>Phallen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+early-stage+cancers+using+circulating+tumor+DNA.">Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA.</a> ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415 (2017).</li><li>Egorov, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers.">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, dimostriamo una suite di protocolli di sequenziamento di correzione d'errore che possono essere facilmente implementati per studiare le mutazioni con VAFs basso in diverse malattie. Il fattore più importante è l'incorporazione di UNMIS con ogni molecola prima di sequenziamento che permettono la correzione degli errori del crudi si legge. I metodi descritti qui permettono ai ricercatori di incorporare UNMIS personalizzato pannelli disponibili in commercio gene sia auto-progettato i oligos gene-specifico.
Protocollo standard di NGS esclude la rilevazione di mutazioni con VAF inferiore al 2% a causa del tasso di errore di sequenziamento, e questo limita l'applicazione di NGS in studi in cui il rilevamento di varianti rare è cruciale. Aggirando il tasso di errore standard di NGS, ECS consente un rilevamento sensibile di queste varianti crude. Per esempio, rilevazione di mutazioni patogene quando queste mutazioni derivano in primo luogo (quindi avendo basso VAF) è assolutamente necessario informare l'intervento precoce della malattia14,15. Nella ricerca di leucemia, la rilevazione di residua minima malattia (le cellule leucemiche residue post-trattamento) informa la stratificazione del rischio e potrebbero essere utilizzata per informare le opzioni di trattamento in modo che le valutazioni di cytometric di flusso binario non possono. Inoltre, ECS è applicabile per rilevare circolanti dell'acido nucleico del tumore e di valutare il potenziale metastatico in pazienti di tumore solido da valutare per la presenza/assenza, come pure l'onere di variante di determinate mutazioni che sono caratteristiche del primario tumore16.
Come dimostrato nella tabella 1, il potere di usare il modello di errore di posizione-specifiche basate su distribuzione binomiale per chiamare varianti dipende in gran parte il numero di librerie in sequenza così come la profondità del sequenziamento utilizzato per compilare il modello di errore. La robustezza del modello errore aumenta con il più alto numero di campioni e una maggiore profondità di sequenziamento. È consigliabile utilizzare almeno 10 campioni in sequenza con una media di correzione d'errore lettura copertura di 3000 x per campione per costruire un profilo di errore per ogni campione. L'approccio di posizione-specifiche è simile a Mastrapasqua, ma invece di utilizzare un tasso di errore di aggregazione per tutte le tipologie diverse di sostituzione (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, abbiamo il modello ogni sostituzione indipendentemente in ogni posizione. Per esempio, un tasso di errore di C > T in una determinata posizione genomica è diversa da un'altra posizione. Il nostro approccio inoltre prende in considerazione un effetto di batch di sequenziamento, come il tasso di sostituzione bassa osservato in una sequenza esecuzione potrebbe essere diverso da un altro giro. Quindi è importante per ogni posizione per tutti i tipi di sostituzione di modello, soprattutto quando campioni da sequenziamento diverse esecuzioni sono riuniti per creare il modello.
Una considerazione importante quando si progetta un esperimento ECS è la soglia di rilevamento desiderato. La bellezza di studi NGS è che può essere facilmente scalate in termini di obiettivi/geni di interesse, soglia di rilevamento (dettata dalla profondità del sequenziamento) e numero di individui interrogati. Ad esempio, se i ricercatori sono interessati a trovare rare mutazioni in due ampliconi con una soglia di rilevamento di 0,0001, essi possono piscina al massimo 75 campioni in un singolo sequenziamento eseguito utilizzando chimica MiSeq V2 che uscite fino a 15 milioni di letture (2 ampliconi * 10.000 molecole * 10 legge per correzione di errore * 75 campioni = 15 milioni sequenziamento letture). I ricercatori possono variare il numero di molecole andando in sequenza o il numero di campioni riuniti in un singolo ordinamento eseguire per regolare la soglia di rilevamento. Nei nostri studi, abbiamo mirato a trovare le mutazioni con una soglia di rilevamento di 0,0001 VAF (01:10, 000) utilizzando il pannello di gene Illumina. Utilizziamo abitualmente 250 ng di a partire del DNA per garantire che le molecole sufficienti sono acquisiti al fine di raggiungere la soglia di rilevamento di cui sopra. I ricercatori possono scegliere di iniziare con bassa quantità di DNA (50 ng è consigliato) se il limite di rilevamento desiderato è > 0.001 VAF.
Come l'UNMIS vengono aggiunti gli indici di i5, sequenziamento impostazioni devono essere modificato di conseguenza. Ad esempio, abbiamo usato 16 N UNMIS, e le impostazioni di sequenziamento sono stati accoppiati fine 2 x 144 letture, 8 cicli di indice 1 e 16 cicli di indice 2 anziché gli usuali 8 cicli di indice 2. L'aumento nel ciclo di indice 2 è compensato da una diminuzione del numero totale di cicli allocata per la legge. Se i ricercatori optano per utilizzare 12N UNMIS10,17, le impostazioni devono essere modificate per 12 cicli di indice 2.
Questo metodo di sequenziamento UMI è ottimizzato per correggere errori di sequenziamento. Rimane non ottimale nel trattare con jackpotting PCR, che è un problema per tutti i metodo basato sull'amplificazione. Abbiamo effettuato turni di post- sequenziamento e post-bioinformatica convalida utilizzando ddPCR, e abbiamo appena rilevare eventuali falsi positivi a causa di jackpotting PCR. Ciò nonostante, si raccomanda che i ricercatori conducono gli esperimenti usando polimerasi ad alta fedeltà per evitare errori di amplificazione basso.

Come abbiamo età, esposizione a sostanze mutagene e stocastici errori durante la divisione cellulare risultato nell'accumulazione delle aberrazioni somatiche nel genoma e questo è alla base della patogenesi fondamentale di trasformazione maligna, malattie neuro-inerente allo sviluppo, pediatriche disordini e invecchiamento normale1,2. Mutazioni somatiche con potenziale di malattia-guida sono importanti biomarkers diagnostici e prognostici per la diagnosi precoce e rischio gestione3,4,5. Per capire meglio clonogenesis fisiologico, che informerà clinica e di ricerca decisioni, accurata quantificazione e caratterizzazione di queste mutazioni è di primaria importanza. Sequenziamento di nuova generazione (NGS) attualmente è usato per studiare mutazioni clonali in campioni di DNA eterogenee; Tuttavia, è limitata all'identificazione di mutazioni a NGS > 0.02 frazione allele variante (VAF) — a causa del tasso di errore inerente di 0,5 – 2,0% del sequenziamento piattaforme6,7,8. Di conseguenza, monitoraggio diagnostico e prognosticamente significative varianti somatiche a VAF inferiore non possono essere realizzati utilizzando standard NGS.
Recentemente, i vari metodi sono stati sviluppati al fine di eludere il tasso di errore di NGS8,9,10,11. Questi metodi utilizzano molecolare tagging, che permette la correzione di errore dopo la sequenziazione. Ogni molecola o frammento genomic nella libreria di sequenziamento è etichettata con una casuale univoco molecolare identificatore (UMI) che è specifico per quella molecola. L'UNMIS sono costruiti da permutazioni di una stringa di nucleotidi randomizzate (N 8 – 16). Un secondo campione specifico codice a barre è anche integrato nel workflow che consente di multiplexing campioni multipli nel sequenziamento NGS stesso eseguito. L'amplificazione di PCR viene eseguita sulla libreria molecolarmente taggata, e successivamente la libreria viene inviata per il sequenziamento. Durante la preparazione della biblioteca, si prevede che gli errori saranno casualmente introdotto al frammento genomico durante l'amplificazione di PCR e sequenziamento8. Per rimuovere gli errori di sequenziamento casuale, sequenziamento crudo letture sono raggruppate secondo l'UMI. Artefatti da sequenziamento non dovranno essere presenti in tutte le letture con l'UMI stesso nella stessa posizione genomica a causa della natura stocastica di introduzione, considerando che una vera variante verrà essere fedelmente amplificata ed ordinata in tutte le letture che condividono la stessa UMI. I manufatti sono bioinformatically rimosso. Qui, descriviamo tre metodi di correzione d'errore Sequencing (ECS) ottimizzati sia in laboratorio per il DNA identificare varianti di singolo nucleotide (SNVs) e piccole inserimento-delezioni (Indels) e per il RNA facilitare la quantificazione dell'espressione genica sotto il Soglia di errore NGS.
Il primo metodo viene descritto un modo per cercare di raro evento somatico utilizzando primers specifici del gene progettato dai ricercatori. Prima della preparazione di libreria, i ricercatori dovrebbero disegnare primers per indirizzare i frammenti di interesse. Abbiamo usato la web-app Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Ampliconi di 200 – 250 bp sono ideali per reazione a catena della polimerasi (PCR) come questi, una volta che è stata integrata UNMIS, generare letture di fine accoppiato con 150 bp fine accoppiato letture di sovrapposizione. Le condizioni di progettazione ottimale primer da utilizzare sono: dimensione minima primer = 19; Dimensione ottimale primer = 25; Dimensione massima primer = 30; Minimo Tm = 64 ° C; Ottimale Tm = 70 ° C; Massimo Tm = 74 ° C; Differenza massima Tm = 5 ° C; Minimo contenuto di GC = 45; Massimo contenuto di GC = 80; Numero da restituire = 20; Massimo 3' fine stabilità = 100.
Nel metodo 2, descriviamo un metodo che unisce il protocollo ECS-DNA con Illumina chimica di indagine per SNVs clonale e piccolo Indels raro come 0,0001 VAF utilizzando pannelli di gene commercialmente disponibili che includono centinaia di ampliconi. Abbiamo usato il TruSight mieloide Sequencing pannello (Illumina) per il nostro esperimento e progettato un pannello espanso per includere ulteriori geni di interesse per le malattie pediatriche mieloide. Questi pannelli non hanno offerto molecolari identificatori univoci (UNMIS) che faciliterebbero la correzione degli errori, così abbiamo aggiunto la nostra strategia di adattatore per questi pannelli. ECS dovrebbe funzionare altrettanto bene con altri pannelli pensati per arricchire per geni associati a malattie diverse. Dopo isolamento del DNA e la successiva quantificazione dal tessuto o il campione di interesse, si raccomanda di avere almeno 500 ng di stock di DNA per esemplare. Facciamo abitualmente una libreria singola sequenza utilizzando 250 ng di DNA al fine di catturare a valle come molto unico frammento genomic da possibili per legge de-duplicazione e calcolo VAF. Una libreria di sequenziamento replica opzionale può essere fatta con i rimanenti 250 ng di DNA. Facciamo sempre due librerie di replicare per campione, e consideriamo solo gli eventi rilevati in modo indipendente in entrambi replicati come veri positivi. Abbiamo anche implementato un modello di genomica errore binomiale di posizione-specifiche per aumentare la precisione della variante chiamata4,13.
Infine, descriviamo un metodo accoppiamento ECS al sequenziamento di RNA per la quantificazione di trascrizione utilizzando pannelli di QIAseq mirati RNA COTS (Qiagen). L'UNMIS necessaria per-duplicazione e correzione di errore sono state integrate nei kit, e i ricercatori possono rendere librerie seguendo le raccomandazioni del produttore. Bioinformatically, i ricercatori possono seguire la pipeline descritta per ECS-DNA, che verrà spiegato in dettaglio nella sezione protocollo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-130-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI i5 adapter sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7442S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7595S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSight Myeloid Sequencing Panel</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-130-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie 2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized QIAseq Targeted RNA Panel</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plus Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rare event detection using error-corrected dna and rna sequencing

Tecniche di sequenziamento di nuova generazione convenzionale (NGS) hanno permesso per la caratterizzazione genomica immenso per oltre un decennio. In particolare, NGS è stato utilizzato per analizzare lo spettro delle mutazioni clonali nella malignità. Anche se molto più efficiente rispetto ai metodi tradizionali Sanger, NGS lotte con l'identificazione di mutazioni rare clonale e subclonal a causa del suo alto tasso di errore pari al ~0.5–2.0%. Così, NGS standard ha un limite di rilevazione per le mutazioni che sono > 0.02 frazione allele variante (VAF). Mentre il significato clinico per le mutazioni di questo raro in pazienti senza malattia conosciuta rimane poco chiara, i pazienti trattati per leucemia hanno migliorato significativamente i risultati quando malattia residua è < 0,0001 tramite flusso cytometry. Per mitigare questo sfondo artefactual di NGS, sono stati sviluppati numerosi metodi. Qui descriviamo un metodo per la correzione d'errore del DNA e RNA Sequencing (ECS), che coinvolge tagging singole molecole con un indice casuale di 16 bp per correzione di errore sia un indice di paziente-specific bp 8 per multiplexing. Il nostro metodo è in grado di rilevare e monitorare clonale mutazioni all'allele variante frazioni (VAFs) due ordini di grandezza inferiore rispetto al limite di rilevazione di NGS e rari come 0,0001 VAF.

Con Targeted Error-Corrected sequenziamento del DNA, abbiamo effettuato una prova dell'esperimento di principio diluendo paziente mutante del DNA nel DNA genomico commerciale. Il paziente ha avuto una mutazione in GATA1 (chrX:48650264, C > G) con originale VAF di 0,19. Dimostriamo che nella Figura 1 che ECS è quantitativa ad un livello di 1: 10.000 per la variante di singolo nucleotide.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> Figura 1: serie di diluizioni di GATA1 SNV dimostrando che ECS è quantitativa al livello di 1: 10.000. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Mostriamo anche che l'ECS-DNA rileva in modo affidabile clonale rare mutazioni in geni ricorrentemente in adulta leucemia mieloide acuta (AML) in individui anziani sani4. Abbiamo ottenuto i campioni del cappotto buffy da 20 individui sani nello studio della salute degli infermieri incassato circa ~ 10 anni di distanza. Abbiamo applicato il protocollo di pannello ECS-DNA su questi campioni. Per questo esperimento, abbiamo adattato la Illumina TruSight mieloide Sequencing pannello che consiste degli 568 ampliconi (maggiori informazioni su elenco gene su https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html) ed ordinato 80 librerie da 20 individui (2 raccolte in diversi momenti, 2 ripetizioni per individuali a tempo punto) utilizzando la piattaforma Illumina NextSeq, che ha generato una media di 47,7 milioni accoppiato-fine letture e una media di 3,4 milioni correzione d'errore sequenze di consenso per biblioteca4. La copertura media del nucleotide per biblioteca era di circa 6.000 x (3,4 milioni divisi per 568). Per ogni campione, abbiamo costruito un profilo di posizione-specifiche errore utilizzando in sequenza le librerie che non sono dallo stesso campione. Abbiamo trovato 109 clonale mutazioni somatiche che erano presenti in entrambi replicati del punto di tempo di almeno un insieme. Queste mutazioni hanno VAF che vanno da 0,0003 – 0.1451. Abbiamo selezionato 21 mutazioni con rappresentazioni note cosmiche e convalidato 21 tutte le mutazioni in uno o due punti di tempo insieme utilizzando ddPCR (n = 34, Figura 2, adattato da giovane et al 20164).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> Figura 2: mutazioni identificate da ECS sono state verificate tramite ddPCR con VAFs altamente concordanti. (n = 34, per l'ultima volta da giovane et al 20164). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Rispetto al livello di espressione di correzione d'errore tramite protocollo ECS-RNA, abbiamo personalizzato un pannello di gene usando QIAseq chimica che consiste dei 416 geni conosciuti per essere associato con vari tipi di cancro (adattati da QIAseq umano cancro Transcriptome pannello) e abbiamo amplificato l'esone più comunemente espressa di un dato gene (elenco di Gene in 1 materiale supplementare). Abbiamo ordinato le librerie utilizzando Illumina MiSeq piattaforma in formato accoppiato-fine che ha dato una media di 8,3 milioni di letture per libreria, e siamo riusciti a catturare una media di 0,417 milioni sequenze consenso di correzione d'errore. Abbiamo dimostrato che il livello di espressione della trascrizione di abbondanza bassa (< trascrizione 1.000 totali in 50 ng di RNA totale) è altamente riproducibile tra repliche (punto dati n = 300, Figura 3). Convalida di ddPCR (sei geni selezionati di grado variabile dell'espressione) ha dimostrato che il livello di espressione dei geni era stato catturato correttamente dal protocollo ECS senza la necessità di normalizzazione.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> Figura 3: Top, correlazione di trascrizione conta di ECS-RNA tra repliche dello stesso campione (n = 300). Fondo, trascrizione identificati da ECS i conteggi sono stati verificati da ddPCR (n = 6). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sequenziamento di nuova generazione (NGS) è un potente strumento per la caratterizzazione genomica che è limitato per l'alto tasso di errore della piattaforma (~0.5–2.0%). Descriviamo i nostri metodi di sequenziamento di correzione d'errore che ci permettono di ovviare il tasso di errore NGS e rilevare le mutazioni alle frazioni di variante allele rare come 0,0001.

Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

11.9K Views.  Washington University School of Medicine. Sequenziamento di nuova generazione (NGS) è un potente strumento per la caratterizzazione genomica che è limitato per l'alto tasso di errore della piattaforma (~0.5–2.0%). Descriviamo i nostri metodi di sequenziamento di correzione d'errore che ci permettono di ovviare il tasso di errore NGS e rilevare le mutazioni alle frazioni di variante allele rare come 0,0001.

Video: Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

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Genetica

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

Valutazione della contaminazione da DNA a RNA campioni basati sul DNA Ribosomal

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

Purificazione di alto peso molecolare genomico da oidio per lungo-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

Sequenziamento di MicroRNA retrospettiva: Protocollo di preparazione libreria DNA complementare utilizzando campioni di RNA di paraffina-incastonato formalina-fisso

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenziamento dell'mRNA da sangue intero utilizzando il sequenziamento di NanoPore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...