Name: visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices
Uploaded: 2018-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von Bernstein Center for Computational Neuroscience Berlin, Humboldt Universität Zu Berlin, des Deutschen Zentrums für Neurodegenerative Erkrankungen (DZNE), das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, Förderkennzeichen unterstützt. 01GQ1001A), NeuroCure, und der Gottfried Wilhelm Leibniz-Preis der deutschen Forschungsgemeinschaft. Wir danken Shimpei Ishiyama für hervorragende Grafik-Design und Juliane Diederichs für ausgezeichnete technische Unterstützung.

Alle experimentelle Verfahren wurden nach den deutschen Richtlinien im Bereich des Tierschutzes unter der Aufsicht der lokalen Ethik-Kommissionen (LaGeSo) durchgeführt. Mensch und Fledermaus Gehirn Daten stammen aus Naumann Et Al. 5 die folgende Prozedur erfolgt auf einer männlichen Erwachsenen Wistar Ratte (Stamm: RJHan:WI).
(1) Perfusion und Gehirn Extraktion
Hinweis: Um eine homogen fest und frei von Blut Gehirn zu erhalten, ist Transcardial Perfusion des Tieres dringend empfohlen, da verbleibende Blut unspezifische Hintergrundsignal während der Färbung erhöht. Dennoch ist es auch möglich, abgeflachten Abschnitte von UN-perfundierten Exemplar erhalten und färben sie. Die einfache Handhabung der Probekörpers hängt von der Konzentration des Fixiermittels verwendet. Zu wenig Fixierung erhöht das Risiko der Umgang mit Schädigung des Gehirns beim abflachen und schneiden, während zu hohe Konzentration die Flexibilität zum Abflachen und die Färbung Signalqualität zu senken.
<ol><li>Transcardially Durchspülen des Tieres mit einer 23G-Nadel. Eine ausführlichere Anleitung finden Sie unter Gage Et al. 9<ol>
<li>Verwenden Sie Phosphat Puffer Kochsalzlösung10 (PBS 0,02 M; pH 7,4) zu spülen, Blut aus dem Gehirn und den Körper des Tieres. Fortgesetzt, bis die Infusion Flüssigkeit klar, mit mindestens 150 mL PBS wird über das Gefäßsystem infundiert wird angezeigt. Hinweis: Die besten Ergebnisse werden erzielt bei einem Druck ähnlich wie das Spektrum der physiologischen Blutdruck des Tieres durchblutet wird (z.B., Ratte: 120-130 MmHg). Optional fügen Sie Heparin (10 U/mL hinzu), die Lösung für Blut Koagulation11zu vermeiden.</li>
		<li>Um das Gehirn zu beheben, die Transcardially mindestens 100 mL Paraformaldehyd12 Infusion (PFA, 4 %, in 0,1 M Phosphat-Puffer (PB)13) bis der Hals des Tieres steif ist. Achtung: PFA ist ein potential Karzinogen. Hinweis: Für histochemische Färbung, wie z. B. Cytochrom-Oxidase Aktivität besten Ergebnisse werden erzielt, wenn 2 % PFA. Für andere Färbung, wie z. B. Immunohistochemistry, 4 % PFA wird bevorzugt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extrahieren Sie das Gehirn aus dem Schädel. Hinweis: Siehe Gage Et al. 9 für Details.<ol>
<li>Isolieren Sie den Kopf mit großen Scheren oder Knochen Scheren.</li>
		<li>Mit einer feinen Schere, schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie von Hals, Nase. Auseinanderziehen der Haut um den Schädel zu entlarven. Entfernen Sie Hals und zeitlichen Muskeln mit feiner Schere.</li>
		<li>Machen Sie eine Mittellinie durch den interparietal Knochen ab das Foramen Magnum bis zu den Parietal Knochen geschnitten.</li>
		<li>Verwenden Sie Rongeurs, um die interparietal Knochen abziehen. Schieben Sie feine Schere entlang der sagittale Naht und schneiden Sie vom hinteren Ende der parietalen am vorderen Ende der Stirnbeine.</li>
		<li>Verwenden Sie Rongeurs, um der parietalen und Stirnbeine abziehen. Alternativ, heben Sie die Knochen entfernt mit Pinzette. Verwenden Sie einen Löffel zu schneiden ventralen Nervenstränge und das Gehirn zu entfernen. Das Gehirn auf PB (0,1 M, pH 7,4) übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>UN-perfundierten Gehirne zu beheben, durch Eintauchen in 4 % PFA für 1-3 h bei 4 ° C (abhängig von der Größe des Gehirns und Sonde: Zähmung: ~ 1 h, Human: ~ 3 h). Hinweis: Für große und Gyrencephalic Gehirne wie die Menschen isolieren und den Bereich von Interesse, Fixierzeit zu reduzieren.</li>
	<li>Um größeren kortikalen Bereiche in einem Abschnitt zu erhalten, glätten Sie das Gehirn vor weiteren Post-Fixierung; fahren Sie mit Schritt 2 fort. Jedoch um Teile der schwerer zugänglichen Bereichen wie den medialen entorhinalen Kortex zu erhalten, nach dem Beheben des Gehirns bei 4 % PFA für 24 h bevor Sie mit Schritt 2 fortfahren.</li>
</ol>2. Präparation und Abflachung des Gehirns
<ol><li>Trennen Sie die Gehirnhälften mithilfe einer Rasierklinge (Lissencephalic Köpfe) oder Skalpell (Gyrencephalic Köpfe). Hinweis: Wenn das Gehirn nach dem nicht feststeht, ist es anfällig für Beschädigungen durch Handhabung.</li>
	<li>Optionaler Schritt für die Unterstützung der nachfolgende Abschnitt Registrierung und Schrumpfung Schätzung:<ol>
<li>Punktion den Kortex auf einer Fläche von nicht-Interesse, mit einer 35G-Nadel senkrecht zur kortikalen Fläche. Wiederholen Sie Schritt zwei Mal in definierten Abständen entlang der kortikalen Blatt. Um den Abstand entlang der kortikalen Blatt zu bestimmen, verwenden Sie einen vorgeschnittenen Thread auf eine feste Länge (z.B. 5 mm) und legen Sie es entlang der kortikalen Oberfläche Punkte der Punktion zu bestimmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lissencephalic Gehirne: subkortikale Strukturen mithilfe einer sezierenden Spachtel entfernen. Kritisch: Halten Sie das Gehirn feucht mit PB (0,1 M, pH 7,4) während des gesamten Verfahrens.<ol>
<li>Halten Sie das Gehirn durch das Kleinhirn und sanft legen Sie den Spatel um eine Dissektion Flugzeug im Corpus Callosum zu öffnen. Die Runde Spitze des Spachtel darauf von der Hirnrinde.</li>
		<li>Schieben Sie die Spachtel weiter und ziehen Sie, bis die Spachtel zwischen dem Thalamus und Kortex ist. Separate subkortikalen Strukturen mit Kratzen Bewegungen.</li>
		<li>Überprüfen der Hemisphäre für gleichmäßige Dicke. Hinweis: Alle unebenen Regionen könnte ein Trans-Schicht Gefälle während Schnitt führen. Verwenden Sie für tangentiale schneiden ein Skalpell, um einen sauberen Schnitt durch das Gehirn parallel zur pial Oberfläche der Region machen aus dem tangentialen Abschnitte gewünscht werden.</li>
		<li>Optionale Schritte zur Abflachung Qualitätsverbesserung:<ol>
<li>Machen Sie einen sauberen Schnitt durch das Striatum, Nucleus Accumbens und orbitofrontalen Kortex, da sie die Dicke der Rinde in der lateralen Region erhöhen. Fügen Sie außerdem einen Linderung Schnitt an der Basis des inneren Bereich des präfrontalen Kortex, der ermöglicht die Entfaltung des medialen Teile des Cortex.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Legen Sie die Hemisphäre (Kortex nach unten) auf einen Objektträger. Fahren Sie mit Schritt 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gyrencephalic Gehirne: Entfernen der weißen Substanz Windungen zu entfalten (ausführliche Protokolle finden Sie unter: Sincich Et Al. 14; Tootell und Silverman (15). Kritisch: Verwendung PB (0,1 M; pH 7,4), das Gehirn feucht zu jeder Zeit zu halten.<ol>
<li>Ein feuchtes Filterpapier in einer großen Petrischale, setzen Sie den gewünschten Bereich mit dem Kortex nach oben auf.</li>
		<li>Entfernen Sie die Arachnoidea Membran und Pia mit zwei Pinzetten.</li>
		<li>Verwenden Sie einen feuchten Wattestäbchen und einführen Sie vorsichtig, in jeder Sulcus, Verwachsungen zwischen den Windungen zu lösen.</li>
		<li>Umdrehen Sie das Gehirn mit einem anderen feuchten Filterpapier.</li>
		<li>Verwenden Sie zwei gebogene Mikro Spachtel um zu einzelnen Windungen zu entfalten. Verwenden Sie die konvexe Seite der Spatel, um der weißen Substanz auseinander zu necken, bis hin zu nahe an das konkave Ende der Gyrus. Verwenden Sie einen feuchten Wattestäbchen und fahren Sie mit wirbelnden Bewegungen, konkave Ende der Gyrus zu erreichen.</li>
		<li>Neben einzelnen Windungen zu necken. Falls erforderlich, fügen Sie kleine Entlastung schneidet, wenn die Spannung zu hoch ist.</li>
		<li>Glätten Sie entfaltete Gehirn in der Petrischale oder einen ähnlichen Behälter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optional legen Sie größere Gehirne auf einem Filterpapier bedeckt Schwamm, um sicherzustellen, dass die Regionen nicht austrocknen.</li>
	<li>Legen Sie zwei gerollte Stücke von Ton auf beiden Seiten. Kritisch: Wie die Dicke des Tons legt fest, wieviel die Hemisphäre abgewickelt werden kann, sicherstellen, dass der Ton 10-20 ist % dünner als die UN-abgeflachte Kortex.</li>
	<li>Drücken Sie vorsichtig eine zweiten Glas Folie/kleine Petrischale auf der Rinde, bis die Hemisphäre komplett flach ist. Um die besten Ergebnisse für eine gewünschte Region zu erhalten, legen Sie die Glas-Folie zuerst auf den entsprechenden Bereich. Um die besten Ergebnisse für Lissencephalic Gehirne zu erhalten, legen Sie den Objektträger tangential an den seitlichen Teil zuerst und konzentrierten Druck auf diese Region.</li>
	<li>Setzen Sie eine Gewicht (z.B. einem keramischen Uhrglas) auf der Glas-Folien/Petrischale und Glätten der Hemisphäre für 3-5 h bei 4 ° C in PB.</li>
	<li>Lassen Sie für Post-Fixierung den Druck und entfernen Sie die Glasplatten zu. Aufsetzen der abgeflachten Halbkugel in PFA (frei schwebend) für 24 h einen Shaker bei 4 ° C. Hinweis: Beste Ergebnisse für histochemische Aktivität Keramikschalen werden erzielt, wenn 1 % mit PFA. Für andere Färbungen, wie z. B. Immunohistochemistry, für UN-perfundierten Gehirne, 2 % PFA verwendet werden kann.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Workflows für Abflachung der eine Ratte kortikalen Hemisphäre und Visualisierung von Modulen im somatosensorischen Kortex. Im Anschluss an die Transcardial Durchblutung des Gehirns einer Maus wurde seziert (A). Subkortikale Strukturen wurden entfernt und Kortex wurde zwischen zwei Glasplatten in Phosphatpuffer (B) dem Erdboden gleichgemacht. Abgeflachte Halbkugel (C) war nach dem fest, tangential geschnitten und gebeizt für Cytochrom-Oxidase-Aktivität (D). Skalieren von Balken = 1 cm. R: Rostral, C: am L: seitlich, M: Medial. Abbildung von Lauer Et Al. angepasst 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
3. Schneiden Tangential Abschnitte
Hinweis: Je nach den Anforderungen der Färbung Protokolle können der Schneidvorgang und Dicke angepasst werden. Ein Vibratome wurde verwendet, um den Hemisphären für histochemische Weiterverarbeitung (Schritt 3.2) auf 80-150 µm geschnitten. Jedoch für immunhistochemische Verarbeitung dünnere Sektionen sind erwünscht und ein Einfrieren Mikrotom diente für Stationspunkte (Schritt 3.3) bei 10-60 µm. Sehen Sie Video 1.
<ol><li>Waschen Sie die abgeflachte Halbkugel in PB (0.1M; pH 7,4) für 15 Minuten.</li>
	<li>Geschnitten Sie die Hemisphäre auf eine Vibratome.<ol>
<li>Ort der Hemisphäre tangential auf dem slicing Halter. Drücken Sie gegebenenfalls noch einmal vorsichtig mit einem Objektträger vor der Befestigung in Position (z.B., mit Sekundenkleber). Hinweis: Minimieren Sie die Kleber verwendet, da aufgrund der geringen Dicke der abgeflachten Halbkugeln schneiden Artefakten führen können.</li>
		<li>Geschnitten Sie die Halbkugel aus dicker und stabiler Ende am Ende dünner (posterior, anterior, hier) an die gewünschte Dicke. Fahren Sie mit Schritt 3.4. Hinweis: Wenn geringe Fixierung Konzentrationen verwendet wurden, schneiden Sie es mit einer langsamen Geschwindigkeit und eine hohe Amplitude.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schneiden Sie die Hemisphäre auf ein Einfrieren Mikrotom.<ol>
<li>Cryoprotect sinkt das Gehirn durch Eintauchen in eine 30 % Saccharoselösung (in PB) bis es. Hinweis: Abhängig von der Größe des Gewebes wird Cryoprotected Untergang in der Lösung von ein paar Stunden bis wenige Tage reichen. Für größere Gehirne alternative Cryoprotection Methoden angesehen werden könnten (siehe Rosene Et Al. ( 16).</li>
		<li>Bilden Sie eine Eis auf der eisigen Mikrotom, das Gehirn zu montieren. Konstruieren Sie das Eis Basis durch Einfrieren PB auf dem Block Gesicht des eiskalten Mikrotom. Kritisch: Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Eis-Basis parallel zu dem Mikrotom Klinge. Um dies zu tun, schneiden Sie das leere Eis Basis mit dem Mikrotom-Messer, die Eis-Basis parallel zu der Schnittfläche exakt auszurichten.</li>
		<li>Betten Sie des Gehirns im eiskalten Medium ein und montieren Sie ihn auf das Gesicht der Block des Mikrotom mit einer Fläche von Interesse, die parallel zu den Block-Gesicht. Gesicht der pial Oberfläche des Gehirns auf die Block-Gesicht der Mikrotom. Kritisch: Passen Sie die Gefriertemperatur je nach Probengröße; höhere Temperaturen besser Abschnitt Integrität sicherzustellen, beim Schneiden, aber größere Abschnitte erfordern niedrigere Temperaturen zum Beispiel gleichmäßig einfrieren.</li>
		<li>Schneiden Sie das Gehirn tangential auf die gewünschte Dicke (langsamer und einheitliche Schnittgeschwindigkeiten führen beste Schnittqualität).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte in PB für 15 min auf einem Boston-Shaker.</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> Video 1: Schematische Video von tangential-Schnitt von einer Ratte mediale entorhinalen Kortex und Anordnung der Module Parasubicular und entorhinalen. Die mediale entorhinalen Kortex des Gehirns, Nagetier befindet sich am hinteren Ende des Kortex und in Richtung der medialen und ventralen Seite gekippt ist. Tangentiale Abschnitte erhält man durch ein Messer entlang dieser Winkel ausrichten. Folglich zeigt die entsprechenden Zelltyp-spezifische Färbung modulare Strukturen im medialen entorhinalen Kortex und angrenzenden Parasubiculum. Video von Ray und Brecht8angepasst. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
(4) Visualisierung der kortikalen Module mit Cytochrom-Oxidase Färbung
Hinweis: Unterschiedliche Färbung Protokolle entwickelt für histochemische Nachweis der Cytochrom-Oxidase Aktivität, z. B.zuerst von Wong-Riley17 und wurden später geändert durch Divac Et al. 18 dieses Protokoll basiert auf der von Divac Et al. 18, da die Verwendung von Nickel-Ammoniumsulfat (NiAS) in einen höheren Kontrast und besser definierte Module in gefärbten kortikalen Areale führt.
<ol><li>Vorbereiten der Cytochrom-Oxidase Färbelösung (siehe Divac Et Al. 18). für 10 mL der Lösung hinzufügen: 10 mL HEPES-Puffer (0,1 M, pH 7,4), 400 mg Saccharose, 12,5 mg NiAS, 2 mg Cytochrom C, 6 mg Diaminobenzidine (DAB). Achtung: DAB und NiAS sind krebserregend. Hinweis: Fügen Sie DAB kurz vor der Inkubation der Abschnitte.</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte in HEPES-Puffer (0,1 M, pH 7,4) auf einen Shaker für 15 Minuten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Abschnitte in der Färbelösung bei Raumtemperatur auf einem Boston-Shaker. Hinweis: Beachten Sie die Geschwindigkeit der Färbung. Wenn es keine sichtbare Reaktion, ändern Sie in Inkubation bei 37 ° C. Abhängig von der Menge der Fixierung kann Färbung nach 10 Minuten oder mehrere Stunden beobachtet werden.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 4 % PFA; Dies verhindert, dass unerwünschte wieder sterben und Erhöhung der Hintergrundsignal.</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitten drei Mal mit HEPES-Puffer für 10 Minuten.</li>
	<li>Montieren Sie und trocknen Sie die Abschnitte auf Objektträgern.</li>
	<li>Entwässern Sie in den Abschnitten mit einer zunehmenden Alkohol-Zeile:<ol>
<li>Waschen Sie Folien in 60 % Ethanol für 1 min. Waschen die Folien in 80 % Ethanol, für 1 min. Waschen die Folien in 96 % igem Ethanol für 2 min. Waschen die Folien in 100 % igem Ethanol für 3 min. Waschen Sie die Folien in Isopropanol für 5 min. die Objektträger in Xylol für 5 min waschen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sofort eine schnelle Aushärtung-Eindeckmittel und hinzufügen ein Deckglas. Kritisch: Verwenden Sie nicht Montage wässrige Medien, wie NiAS ausgewaschen werden wird und die Färbung beeinträchtigen.</li>
	<li>Halten Sie die Abschnitte bei 4 ° C für langfristige Lagerung.</li>
</ol>(5) Visualisierung der kortikalen Module mit immunhistochemischen Färbung
Hinweis: Mehrere Protokolle stehen für Immunohistochemistry, optimiert für die Probe und die Art der Sonde. Anpassungen können je nach Bedarf von unterschiedlichen Konzentrationen von Antikörpern, permeabilizing Agenten und Inkubationszeiten. Das folgende Protokoll führt zu guten Ergebnissen für die Erkennung einer Vielzahl von Antikörpern und Visualisierung durch fluoreszierende Sonden.
<ol><li>Waschen Sie die Abschnitte mit PBS-Puffer (0,1 M, pH 7,4) für 15 Minuten.</li>
	<li>Optional: Führen Sie Antigen-Retrieval um ein Epitop über einem Wasserbad (basierend auf Jiao Et Al. zu entlarven 19; für alternative Methoden siehe Pileri Et al. ( 20).<ol>
<li>Ein Wasserbad auf 80 ° c vorheizen Tri-Natrium-Citrat Puffer19 (pH 8,0) vorbereiten und im Wasserbad auf 80 ° c vorheizen</li>
		<li>Übertragen Sie die Abschnitte auf Tri-Natrium-Citrat-Puffer. Inkubieren Sie die Abschnitte für 30 min bei 80 ° C</li>
		<li>Die Abschnitte auf Zimmertemperatur abkühlen</li>
		<li>Waschen Sie die Abschnitte mit PBS-Puffer für 15 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitten zwei Mal in PBS-X (0,5 % Triton-X, in 0,1 M PBS) für 15 Minuten.</li>
	<li>Unspezifische Epitope durch die Abschnitte in einer Lösung von Rinderserumalbumin (BSA; 2,5 %) und Triton-X (0,75 %) mit PBS-Puffer für 2 h Inkubation zu blockieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Abschnitte in Primärantikörper, z.B.Calbindin - D28k (1:5 000, 1 % BSA in PBS-X), für 2-3 Tage auf einem Schüttler bei 4 ° C. Hinweis: Optimale Verdünnung für den primären Antikörper richtet sich nach den spezifischen Antikörper verwendet. Beziehen sich auf Herstellerangaben Verdünnung Kriterien für einen spezifischen Antikörper zu erhalten. Mehrere Antikörper können zusammen verwendet werden aber gegen verschiedene Arten angehoben werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit PBS-Puffer für 15 Minuten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in Sekundärantikörper (1: 200, 1 % BSA mit PBS-Puffer) bei 4 ° C in einen Shaker geben. Hinweis: Mehrere sekundäre Antikörper können bei verschiedenen Spektren verwendet werden, wenn mehrere primäre Antikörper verwendet wurden.</li>
	<li>Der sekundäre Antikörper durch Waschen in den Abschnitten dreimal mit PBS-Puffer für jeweils 10 min. abwaschen.</li>
	<li>Montieren Sie und trocknen Sie die Abschnitte auf einem Objektträger für die Mikroskopie. Hinweis: Die Abschnitte sollte noch vor der Montage das Deckglas feucht sein.</li>
	<li>Gelten Sie Eindeckmedium geeignet für Fluoreszenz-Farbstoffen auf die Gewebeschnitte und einem Deckgläschen.</li>
	<li>Trocknen Sie die Abschnitte für 1 h.</li>
	<li>Für langfristige Lagerung versiegeln Sie des Deckglases mit Nagellack und halten Sie im Dunkeln bei 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brodmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).</li><li>Naumann, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reptilian+brain.">The reptilian brain.</a> Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).</li><li>Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+columns,+modules,+and+domains+in+the+neocortex+of+primates.">Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).</li><li>Woolsey, T. 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Die Autoren erklären, dass die Forschung in der Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.

Modularität in der Großhirnrinde ist mit einer Vielzahl von Techniken identifiziert worden. Die frühesten Studien in der Regel identifiziert kortikalen Module durch die beiden Visualisierung Zelle dichten Regionen oder fehlender Fasern1. Nachfolgende Methoden haben die Anwesenheit von dendritischen Bündel24, Afferenzen aus einer bestimmten Region25oder Anreicherung von Neurotransmittern26genutzt. Hier zeigen wir zwei Techn...

Einige der wichtigsten Änderungen in der Gehirnstruktur über Phylogenie kann in der Großhirnrinde beobachtet werden. Trotz der erheblichen Unterschiede der Hirnrinde von Tieren folgt ein gemeinsames Muster und kann breit geteilt werden auf zwei verschiedene Arten von Schichten und Bereichen1. Kortikale Schichten liegen parallel zur Oberfläche des Gehirns und variieren in der Zahl von 3 Schichten in Reptilien Cortex2 bis 6 Lagen in Säugetieren Cortex1. Kortikalen Areale auf der anderen Seite sind verschiedene Regionen des Cortex, die unterschiedliche Funktionalitäten, z.B.weitgehend entsprechen, somatosensorische Cortex in der Empfindung des Touch oder den visuellen Cortex bei der Verarbeitung von visuellen Eingänge beteiligt ist. Diese kortikalen Bereiche können oft in Patches oder Module3, unterteilt werden, die regelmäßig zu, anatomische Strukturen, die im wesentlichen parallel zur pial Oberfläche des Gehirns gefunden wiederholen. Kortikale Module können auf einem bestimmten Layer4beschränkt oder erstrecken sich über mehrere Ebenen5.
Strukturierendes Standardmethoden des Gehirns umfassen Abschnitte des Gehirns, wie koronale oder sagittale senkrecht zur Fläche. Während diese Methoden verwendet werden können, kortikale Module zu visualisieren, kann eine Vielzahl von interessanten Features aufgedeckt werden, wenn die kortikalen Module in einer Ebene parallel zur Oberfläche des Gehirns tangential, visualisiert werden. Zum Beispiel somatosensorischen Module im Nagetier Gehirn repräsentieren Schnurrhaare, erscheinen als Fässer als normal auf die Gehirn-Oberfläche visualisiert, und somit die Regionen ableiten den Name Fass Kortex. Jedoch auf die Fässer in einer tangentialen Ausrichtung zu visualisieren, offenbaren sie eine Whisker-Karte, mit den Fässern in einer topographischen Ausrichtung spiegeln das genaue Layout der Schnurrhaare auf die äußere Körperoberfläche angelegt. In bestimmten Fällen modulare Anordnung hat sogar entkommen Erkennung für einen erheblichen Zeitraum, wenn in gewissem Sinne nicht tangential visualisiert. Die mediale entorhinalen Kortex ist bekannt für das Vorhandensein der Gitterzellen, Neuronen, die in einem regelmäßigen hexagonalen Muster zu feuern, wenn ein Tier eine Umgebung durchlaufen ist. Obwohl es eine stark untersuchten Gegend bis vor kurzem, das Vorhandensein von Patches oder Module von Zellen in der medialen entorhinalen Kortex ist, die physisch in einem hexagonalen Muster6angelegt sind geflohen Erkennung. Das Vorhandensein und die Anordnung dieser Module in der Rattengehirn wurde durch tangentiale Abschnitte des medialen entorhinalen Kortex und untersucht die Cytoarchitecture in gewissem Sinne Schichtweiser erleichtert.
Im Anschluss an die schneiden, kann der besondere Aspekt der Visualisierung der kortikalen Module auch auf vielfache Weise realisiert werden. Klassisch, haben Studien Module basierend auf Zelle Dichte oder Faser Layout1abgegrenzt. Ein weiterer beliebter Ansatz ist die Verwendung von Cytochrom-Oxidase Histochemie, die Bereiche der höheren Aktivität8enthüllt. Neuere Ansätze beinhalten Blick auf genetisch bedingte Zelltypen unterschieden auf der Basis ihrer Protein Ausdruck Profile6,8.
In dieser Studie beleuchten wir Methoden zum Isolieren der Hirnrinde von Säugetier-Gehirne, abgeflachte tangential Abschnitte erhalten und kortikalen Module basierend auf Cytochrom-Oxidase Histochemie und Immunhistochemie Zelltyp spezifische Proteine zu visualisieren.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cytochrome oxidase staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c from equine heart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1827</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antigen retrieval&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td><td>Carl Roth</td><td>4984.3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>TRITON-X 100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunohistochemistry&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000347</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000340</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V, biotin free</td><td>Carl Roth</td><td>0163.4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mounting or freezing media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (immunofluorescence)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt (histochemistry)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03989</td><td></td></tr><tr><td>Tissue freezing medium</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0696746</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Alcohol dehydration&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Carl Roth</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Carl Roth</td><td>P075.3</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752.4</td><td></td></tr><tr><td>Xylene substitute</td><td>Fluka</td><td>78475</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Devices/tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 650V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jung RM2035</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps - Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Bone Shears - 24 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>16150-24</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors - Large Loops</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Fine Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices

Der Kortex Säugetier-Gehirne ist Parcellated in verschiedene Unterkonstruktionen oder Module. Kortikale Module in der Regel liegen parallel zu den kortikalen Blatt und können durch bestimmte histochemische und immunhistochemischen Methoden abgegrenzt werden. In dieser Studie stellen wir eine Methode zu den Kortex von Säugetier-Gehirne zu isolieren und zu glätten, um Abschnitte Parallel zu den kortikalen Blatt zu erhalten. Wir weitere Highlight ausgewählt histochemische und immunhistochemischen Methoden, diese zu verarbeiten abgeflacht tangential Abschnitte um kortikalen Module zu visualisieren. Wir führen im somatosensorischen Cortex von verschiedenen Säugetieren Cytochrom-Oxidase Histochemie um Körper Karten oder kortikale Module aus verschiedenen Teilen des Körpers des Tieres zu offenbaren. In der medialen entorhinalen Kortex, ein Gebiet, wo Rasterzellen generiert werden, nutzen wir immunhistochemischen Methoden um Module von genetisch bedingten Neuronen zu markieren, die auf mehrere Arten in einem Raster in der kortikalen Blatt angeordnet sind. Insgesamt bieten wir ein Rahmen zu isolieren und bereiten Ligawechsel kortikale Abschnitte abgeflacht und kortikalen Module mit histochemische und immunhistochemischen Methoden in einer Vielzahl von Säugetier-Gehirne zu visualisieren.

Wir erhalten abgeflachten kortikale Abschnitte des somatosensorischen Kortex in einer Vielzahl von Gehirn und verarbeitet sie für Histochemie Cytochrom-Oxidase, die Somatotopic-Module für verschiedene Körperteile zu visualisieren. Diese vergleichende Ansatz ermöglicht es, studieren die evolutionären Kräfte dieser Form Kortex, z.B.hoch konservierte Darstellung der Mystacial Tasthaare in Nagetieren und Lagomorpha als Fässer21 (Abb...

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Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode abgeflachten tangential Abschnitte von Säugetieren Cortex und kortikalen Module mit histochemische und immunhistochemischen Methoden zu visualisieren.

Visualisierung der kortikalen Module in abgeflachten Säugetier-Rinde

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K Aufrufe.  Humboldt University of Berlin. Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode abgeflachten tangential Abschnitte von Säugetieren Cortex und kortikalen Module mit histochemische und immunhistochemischen Methoden zu visualisieren.

Serie: Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

Wie kortikale Faltung von MR-Bildern messen: eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Local Gyrification Index Compute

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Medizin

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Mehrschicht-Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging in frei beweglichen Mäusen mit Prisma-Sonden und miniaturisierte Fluoreszenzmikroskopie

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Verhalten

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphotonen Mikroskopie Cleared Maushirn Ausdruck YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

In-vivo-Imaging von Deep kortikalen Schichten mit einem MICROPRISMEN

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Biologie

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Visualisierung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain

Source: Slater, B. J., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53067">Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2015)
The video demonstrates the preparation of colliculo-thalamocortical brain slices from mouse pup brains. An isolated brain is aligned on a marked slide and cut at an angle to align the auditory midbrain and forebrain in the same plane. The brain is then sliced using a vibratome, and the slices containing the major auditory midbrain and forebrain structures are transferred to a holding chamber for preservation.

Präparation von kollikulo-thalamokortikalen Schnitten aus dem Gehirn eines Mäusewelpen

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation for and Removal of ...