Name: visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices
Uploaded: 2018-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Humboldt Universität zu Berlin, el centro de Bernstein para Berlín de neurociencia computacional, del centro alemán para enfermedades neurodegenerativas (DZNE), el Ministerio Federal alemán de educación e investigación (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure y Gottfried Wilhelm Leibniz Premio del DFG. Agradecemos a Shimpei Ishiyama de excelente diseño gráfico y Juliane Diederichs excelente asistencia técnica.

Todos los procedimientos experimentales fueron realizados según las directrices alemanas sobre el bienestar de los animales bajo la supervisión de los comités de ética locales (LaGeSo). Humanos y murciélagos cerebro datos fueron derivados de Naumann et al. 5 el siguiente procedimiento se realiza en rata Wistar macho adulto (cepa: RJHan:WI).
1. perfusión y extracción de cerebro
Nota: Para obtener un cerebro fijado homogéneamente y sin sangre, las transcardial la perfusión del animal es muy animada, como sangre residual aumenta la señal de fondo no específica durante la coloración. Sin embargo, también es posible obtener secciones aplanadas del espécimen no perfundido y les mancha. La facilidad de manipulación de la muestra varía con la concentración de fijador utilizado. Fijación insuficiente aumenta el riesgo de manejar el daño en el cerebro durante aplanar y cortar, mientras que concentraciones demasiadas menor flexibilidad para aplanar y la calidad de la señal de tinción.
<ol><li>Transcardially perfusión el animal, utilizando una aguja de 23G. Para una información más detallada, véase Gage et al. 9<ol>
<li>Uso de fosfato buffer salino10 (PBS 0.02 M; pH 7,4) a eliminar sangre desde el cerebro y el cuerpo del animal. Continúe hasta que el líquido de infusión aparece clara, con al menos 150 mL PBS ser infundida a través del sistema vascular. Nota: Se consiguen mejores resultados a una presión similar a la gama de la presión arterial fisiológica del animal siendo perfundido (p. ej., rata: 120-130 mmHg). Opcionalmente, añadir heparina (10 U/mL) a la solución para evitar la coagulación de sangre11.</li>
		<li>Para fijar el cerebro, transcardially infundir un mínimo de 100 mL paraformaldehido12 (PFA, 4%; en fosfato de 0.1 M tampón (PB)13) hasta que el cuello del animal es rígido. PRECAUCIÓN: El PFA es un carcinógeno potencial. Nota: Para la actividad histoquímica de la coloración, tales como la citocromo oxidasa, se consiguen mejores resultados, al utilizar 2% PDA. Para otras manchas, como inmunohistoquímica, 4% PFA es preferido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraer el cerebro del cráneo. Nota: Ver Gage et al. 9 para más detalles.<ol>
<li>Aislar la cabeza con grandes tijeras o los esquileos del hueso.</li>
		<li>Con unas tijeras finas, cortar la piel a lo largo de la línea media del cuello a la nariz. Separe la piel para exponer el cráneo. Quitar el cuello y los músculos temporales con unas tijeras finas.</li>
		<li>Haga una línea media a través del hueso interparietal desde el foramen magnum hasta el hueso parietal.</li>
		<li>Uso de gubias de pelar el hueso interparietal. Deslice las tijeras finas a lo largo de la sutura sagital y corte desde el extremo posterior del parietal en el extremo anterior de los huesos frontales.</li>
		<li>Uso de gubias de pelar los huesos frontal y parietal. Por otra parte, levantar los huesos lejos con unas pinzas. Use una cuchara para cortar cuerdas ventrales del nervio y quitar el cerebro. Transferir el cerebro a PB (0,1 M; pH 7,4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reparar cerebros no perfundidos por inmersión en el 4% PFA para 1-3 h a 4 ° C (dependiendo del tamaño del cerebro y sonda: musaraña: ~ 1 h, humanos: ~ 3 h). Nota: Para grandes y gyrencephalic cerebros como los seres humanos, aislar y cortar el área de interés para reducir el tiempo de fijación.</li>
	<li>Para obtener las áreas corticales más grandes en una sección, aplane el cerebro antes de la fijación más; proceda al paso 2. Sin embargo, para obtener secciones de más difícil llegar a zonas como la corteza del entorhinal medial, después arreglar el cerebro en el 4% PFA por 24 h antes de proceder al paso 2.</li>
</ol>2. disección y aplanamiento del cerebro
<ol><li>Separar los hemisferios del cerebro mediante una hoja de afeitar (lissencephalic cerebro) o un bisturí (gyrencephalic cerebro). Nota: Si el cerebro no se ha corregido después, es susceptible a daños por manejo.</li>
	<li>Paso opcional para ayudar a la estimación de sección posterior registro y contracción:<ol>
<li>La corteza en un área de interés no la punción con una aguja de 35G normal a la superficie cortical. Repita el paso dos veces a distancias definidas a lo largo de la lámina cortical. Para determinar la distancia a lo largo de la lámina cortical, utilice un hilo de corte a longitud fija (por ejemplo, 5 mm) y colóquela a lo largo de la superficie cortical para determinar puntos de punción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cerebros lissencephalic: quitar las estructuras subcorticales usando una espátula de disección. Crítica: Mantenga el cerebro húmedo con PB (0,1 M; pH 7,4) a lo largo de todo el procedimiento.<ol>
<li>Mantenga el cerebro por el cerebelo e inserte suavemente la espátula para abrir un plano de disección en el cuerpo calloso. La punta redonda de espátula debe apuntar a la corteza.</li>
		<li>Deslizar la espátula más lejos y tirar suavemente hasta que la espátula esté entre el tálamo y la corteza. Distintas estructuras subcorticales con movimientos de rascado.</li>
		<li>Inspeccione el hemisferio para incluso el grueso. Nota: Regiones irregulares pueden resultar en un gradiente trans-capa durante el seccionamiento. Para corte tangencial, utilice un bisturí para hacer un corte limpio a través del cerebro, paralelo a la superficie pial de la región de la cual se desean secciones tangenciales.</li>
		<li>Pasos opcionales para mejorar la calidad del acoplamiento:<ol>
<li>Hacer un corte limpio por el cuerpo estriado, Núcleo accumbens y corteza orbitofrontal, puesto que aumentan el espesor de la corteza en la región lateral. También, añadir un corte de alivio en la base de la región interna de la corteza prefrontal, que permite el despliegue de las porciones mediales de la corteza.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque el hemisferio (corteza hacia abajo) sobre un portaobjetos de vidrio. Proceda al paso 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cerebros Gyrencephalic: Quite la materia blanca para desplegar las convoluciones del cerebro (para protocolos detallados, vea: Soledad et al. 14; Tootell y Silverman15). Crítica: Uso PB (0,1 M; pH 7,4) a mantener el cerebro húmedo en todo momento.<ol>
<li>Poner el área de interés en un papel filtro húmedo en un gran plato de Petri, con la corteza hacia arriba.</li>
		<li>Quitar la membrana aracnoide y pia usando dos pinzas.</li>
		<li>Utilice un hisopo de algodón húmedo y suavemente inserte en cada surco para separar las adherencias entre las convoluciones del cerebro.</li>
		<li>La vuelta del cerebro mediante el uso de otro papel de filtro húmedo.</li>
		<li>Utilizar dos espátulas curvas de micro para desplegar solo convoluciones del cerebro. Utilice el lado convexo de las espátulas para embromar aparte la materia blanca hasta llegar cerca del extremo cóncavo de la convolución del cerebro. Utilice un hisopo de algodón húmedo y continuar con movimientos de remolinos para llegar al extremo cóncavo de la convolución del cerebro.</li>
		<li>Embromar apartes solo convoluciones del cerebro. Si es necesario, agregue aliviar pequeños cortes si la tensión es demasiado alta.</li>
		<li>Aplana el cerebro desplegado en la caja Petri o un recipiente similar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opcionalmente, lugar cerebros más grandes en una esponja de filtro de papel cubierto, para garantizar que las regiones no se resequen.</li>
	<li>Coloque dos piezas laminados de la arcilla en ambos lados. Crítica: Como el grueso de la arcilla define cuánto el hemisferio puede ser aplanado, asegurarse de que la arcilla es 10-20% más delgada que la corteza no aplanada.</li>
	<li>Presione suavemente hasta que el hemisferio esté completamente plano una segundo cristal diapositiva pequeña caja de Petri en la corteza. Para obtener los mejores resultados para una región deseada, coloque el portaobjetos de cristal primero en el área respectiva. Para obtener los mejores resultados para cerebros lissencephalic, coloque el portaobjetos de cristal tangencialmente en la porción lateral primero y aplique presión concentrada en esta región.</li>
	<li>Poner un peso (por ejemplo, un vidrio de reloj cerámica) sobre el portaobjetos de vidrio/Petri y aplanar el hemisferio durante 3-5 h a 4 ° C en PB.</li>
	<li>Para la fijación, suelte la presión y retire el portaobjetos. Poner el hemisferio aplanado en PFA (libre flotación) por 24 h en un agitador a 4 ° C. Nota: Se consiguen mejores resultados para los stainings histoquímicos actividad cuando se usa 1% PFA. Para otros los stainings, como inmunohistoquímica, para cerebros sin perfusión, PFA se puede utilizar el 2%.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> Figura 1: representación esquemática del flujo de trabajo para aplanar de un hemisferio cortical de la rata y la visualización de los módulos en la corteza somatosensorial. Después de la perfusión de transcardial, el cerebro de un ratón fue diseccionado (A). Fueron quitadas estructuras subcorticales y la corteza fue aplanada entre dos portaobjetos en tampón de fosfato (B). Hemisferio aplanado (C) post fijo, seccionado tangencialmente y manchado para la actividad de citocromo oxidasa (D). Barras de escala = 1 cm. R: Rostral, Caudal C:, L: Lateral, Medial de la M:. Figura adaptada de Lauer et al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. cortar secciones tangencial
Nota: Dependiendo de los requerimientos de los protocolos de tinción, el procedimiento de corte y el grueso pueden ser adaptados. Un vibratome fue utilizado para cortar los hemisferios más histoquímicas procesamiento (paso 3.2) a 80-150 μm. Sin embargo, para el procesamiento de immunohistochemical, secciones más delgadas son las deseadas y un micrótomo de congelación fue utilizado para seccionamiento (paso 3.3) en 10-60 μm. Ver Video 1.
<ol><li>Lave el hemisferio aplanado en PB (0.1M, pH 7.4) durante 15 minutos.</li>
	<li>Un vibratome corte del hemisferio.<ol>
<li>Lugar del hemisferio tangencialmente en el titular de la corte. Opcionalmente, pulse de nuevo suavemente con un portaobjeto antes de fijar en la posición (por ejemplo, con superglue). Nota: Minimizar la cantidad de pegamento utilizado, porque podrían resultar en artefactos de corte debido al pequeño espesor de hemisferios aplanados.</li>
		<li>Corte el hemisferio desde el extremo más grueso y más estable hacia el extremo más delgado (posterior a la anterior, aquí) en el espesor requerido. Continúe con el paso 3.4. Nota: Si se utilizaron concentraciones bajas de fijación, corte a baja velocidad y alta amplitud.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corte del hemisferio en un micrótomo de congelación.<ol>
<li>Cryoprotect el cerebro sumergiéndolo en una solución de sacarosa al 30% (en PB) hasta que se hunde. Nota: Dependiendo del tamaño del tejido es cryoprotected, se hunde en la solución puede ir desde unas horas hasta unos días. Para cerebros más grandes podrían considerar métodos alternativos de crioprotección (véase Rosene et al. 16).</li>
		<li>Forma de un hielo en el micrótomo de congelación para montar el cerebro. Construir el base del hielo por congelación de PB en la cara del bloque del micrótomo de congelación. Crítica: Asegúrese que la superficie de la base del hielo es paralela a la cuchilla de micrótomo. Para ello, cortar el hielo vacío base usando la cuchilla para Microtomo para alinear exactamente la base de hielo paralela a la superficie de corte.</li>
		<li>Incrustar el cerebro en medio de congelación y montarlo en la cara del bloque del micrótomo con el área de interés paralela a la cara del bloque. Se enfrentan a la superficie pial del cerebro hacia la cara del bloque del microtomo. Crítica: Ajustar la temperatura de congelación dependiendo del tamaño de la muestra; temperaturas más altas garantizar integridad sección mejor de seccionamiento, pero secciones más grandes requieren temperaturas más bajas para congelar la muestra uniformemente.</li>
		<li>Cortar el cerebro tangencialmente en el espesor requerido (velocidades de corte más lento y uniforme resultan en mejor calidad de sección).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lávese las secciones en PB durante 15 min en un agitador.</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> Video 1: video esquemático de secciones tangenciales de una corteza del entorhinal medial de ratas y el diseño de los módulos parasubicular y entorrinal. La corteza del entorhinal medial de un cerebro de roedor está situada en el extremo posterior de la corteza y se inclina hacia el lado medial y ventral. Secciones tangenciales se obtienen por un cuchillo a lo largo de este ángulo de orientación. Por lo tanto, apropiado tipo de célula específico tinción revela estructuras modulares en la corteza entorrinal medial y parasubiculum contigua. Video adaptado de Ray y Brecht8. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
4. visualización de módulos corticales mediante citocromo oxidasa tinción
Nota: Protocolos de tinción diferentes se han desarrollado para la detección histoquímica de la actividad de la citocromo oxidasa, por ejemplo, primero por Wong-Riley17 y más tarde modificado por Divac et al. 18 este protocolo se basa en la una por Divac et al. 18, ya que el uso de sulfato de amonio de níquel (NiAS) resulta en un mayor contraste y mejores definidos módulos de áreas corticales teñidas.
<ol><li>Preparar la solución de tinción de citocromo oxidasa (ver Divac et al. 18). para 10 mL de solución, añadir: tampón HEPES 10 mL (0.1 M, pH 7.4), sacarosa de 400 mg, 12,5 mg NiAS, citocromo C, 6 mg diaminobenzidina (DAB) de 2 mg. PRECAUCIÓN: DAB y NiAS son cancerígenos. Nota: Agregar DAB justo antes de la incubación de las secciones.</li>
	<li>Lávese las secciones en tampón HEPES (0.1 M, pH 7.4) en un agitador durante 15 minutos.</li>
	<li>Incubar las secciones en la solución de tinción a temperatura ambiente en un agitador. Nota: Observe la velocidad de la tinción. Si no hay reacción visible, cambiar a incubación a 37 ° C. Dependiendo de la cantidad de fijación, tinción puede observarse después de 10 minutos o varias horas.</li>
	<li>Detener la reacción agregando 4% PDA; Esto evita que vuelva a morir y el aumento de señal de fondo no deseados.</li>
	<li>Lavar las secciones tres veces con tampón HEPES durante 10 minutos.</li>
	<li>Monte y secar las secciones sobre portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Deshidratar las secciones con una fila cada vez mayor del alcohol:<ol>
<li>Lave los portaobjetos en etanol al 60% durante 1 minuto lavar los portaobjetos en etanol al 80% por 1 minuto lavar los portaobjetos en etanol al 96% por 2 minutos Lave los portaobjetos en etanol al 100% por 3 minutos Lave el portaobjetos en isopropanol para 5 minutos Lave el portaobjetos en xileno durante 5 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inmediatamente un medio de montaje de endurecimiento rápido y añadir un cubreobjetos. Crítica: No utilice medios de montaje a base de agua, como NiAS será eliminada y degradar la tinción.</li>
	<li>Mantener las secciones de 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>5. visualización de módulos corticales mediante tinción inmunohistoquímica
Nota: Varios protocolos están disponibles para immunohistochemistry, optimizado para la muestra y el tipo de sonda. Adaptaciones se pueden hacer como sea necesario, por concentraciones variables de anticuerpos, agentes permeabilizing y tiempos de incubación. El siguiente protocolo conduce a buenos resultados para la detección de una amplia gama de anticuerpos y la visualización de sondas fluorescentes.
<ol><li>Lávese las secciones en PBS (0,1 M; pH 7.4) durante 15 minutos.</li>
	<li>Opcional: Realice el antígeno para desenmascarar a un epitopo mediante un baño de agua (basado en Jiao et al. 19; para métodos alternativos, vea Pileri et al. 20).<ol>
<li>Precaliente un baño de agua a 80 ° C. Prepara tri-sodio citrato buffer19 (pH 8.0) y precalentamiento en baño María a 80 ° C.</li>
		<li>Transferencia de las secciones a tampón de tri-sodio citrato. Incubar las secciones durante 30 min a 80 ° C</li>
		<li>Enfriar las secciones a temperatura ambiente</li>
		<li>Lávese las secciones en PBS durante 15 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lávese las secciones dos veces en PBS-X (0,5% Triton-X, en PBS de 0,1 M) durante 15 minutos.</li>
	<li>Bloquear epitopos inespecíficas por las secciones en una solución de albúmina de suero bovino (BSA; 2,5%) y Triton-X (0,75%) en PBS durante 2 h de incubación.</li>
	<li>Incubar las secciones de anticuerpo primario, por ejemplo, Calbindin - D28k (1:5, 000, 1% de BSA en PBS-X), para 2-3 días en un agitador a 4 ° C. Nota: La dilución óptima para el anticuerpo primario depende del anticuerpo específico utilizado. Consulte la información del fabricante para obtener criterios de dilución de un anticuerpo específico. Anticuerpos múltiples pueden ser usados juntos pero deben elevarse contra especies diferentes.</li>
	<li>Lávese las secciones tres veces en PBS durante 15 minutos.</li>
	<li>Incubar las secciones durante la noche en el anticuerpo secundario (1: 200, 1% de BSA en PBS) a 4 ° C en un agitador. Nota: Múltiples anticuerpos secundarios pueden utilizarse en diversos espectros si se utilizaron varios anticuerpos primarios.</li>
	<li>Lave el anticuerpo secundario lavando las secciones tres veces en PBS durante 10 minutos.</li>
	<li>Monte y secar las secciones en un portaobjetos de vidrio para microscopio. Nota: Las secciones deben estar húmedas antes de montar el cubreobjetos.</li>
	<li>Medio de montaje para fluorescencia colorantes en las secciones de tejido se aplica y se aplica un cubreobjetos.</li>
	<li>Secar las secciones para 1 h.</li>
	<li>Para almacenamiento a largo plazo, sello el cubreobjetos usando esmalte de uñas y mantener en la oscuridad a 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pueda interpretarse como un potencial conflicto de interés.

Modularidad en la corteza cerebral se ha identificado con una variedad de técnicas. Los primeros módulos corticales estudios típicamente identificados ya sea visualizando la célula regiones densas, o la ausencia de fibras1. Métodos posteriores han utilizado la presencia de paquetes dendríticas24, aferentes de una región particular25o enriquecimiento de neurotransmisores26. Aquí muestran dos técnicas de histoquímica d...

Algunos de los cambios más significativos en la estructura del cerebro a través de la filogenia pueden observarse en la corteza cerebral. A pesar de diferencias significativas, la corteza de los animales sigue un patrón común y se puede dividir ampliamente en dos maneras distintas, por capas y áreas1. Capas corticales se encuentran paralelas a la superficie del cerebro y varían en número de 3 capas de cortezas reptiles2 a 6 capas de cortezas mamíferos1. Áreas corticales por el contrario son distintas regiones de la corteza que en gran parte corresponden a diferentes funcionalidades, por ejemplo, la corteza somatosensorial está implicada en la sensación de tacto o la corteza visual en el procesamiento de entradas visuales. Estas áreas corticales pueden a menudo ser subdivididas en parches o módulos de3, que regularmente están repitiendo las estructuras anatómicas, encontradas esencialmente paralelas a la superficie pial del cerebro. Módulos corticales pueden limitarse a un determinado nivel4, o extienden a través de varias capas5.
Métodos estándar de seccionamiento del cerebro involucran las secciones normales a la superficie del cerebro, como coronal o sagital. Aunque estos métodos pueden utilizarse para visualizar los módulos corticales, una multitud de características interesantes puede ser revelada cuando los módulos corticales se visualizan tangencialmente, en un plano paralelo a la superficie del cerebro. Por ejemplo, módulos somatosensoriales en el cerebro de roedor que representa bigotes, aparecen como barriles cuando es visualizado normal a la superficie del cerebro, y así las regiones derivan de la corteza del cañón de nombre. Sin embargo, en la visualización de los barriles en una orientación tangencial, revelan un mapa de barba, con los barriles que están establecidos en una orientación topográfica reflejando la disposición exacta de los bigotes en la superficie externa del cuerpo. En ciertos casos, arreglo modular incluso ha escapado detección durante periodos considerables, cuando es visualizado de manera no tangencial. La corteza del entorhinal medial, se caracteriza por la presencia de células de la red, las neuronas que cuando un animal mueve por medio del fuego en un patrón regular hexagonal. Aunque es un área muy investigada, hasta recientemente, la presencia de parches o módulos de células en la corteza del entorhinal medial, que físicamente se presentan en un patrón hexagonal6, había escapado detección. La presencia y la disposición de estos módulos, en el cerebro de la rata, fue facilitada por hacer secciones tangenciales de la corteza del entorhinal medial e investigar la Citoarquitectura de manera capa-sabio.
Después de seccionar, el aspecto particular de visualización de módulos corticales también puede realizarse de múltiples maneras. Clásicamente, los estudios han delineado módulos basados en células densidad o fibra de diseño1. Otro método popular es el uso de histoquímica de la citocromo oxidasa, que revela las áreas de mayor actividad8. Enfoques más recientes incluyen mirar tipos de células genéticamente determinada, distinguidos sobre la base de su proteína expresión perfiles6,8.
En este estudio, se destacan los métodos para aislar la corteza del cerebro mamífero, obtener secciones tangenciales aplastadas y visualizar módulos corticales basados en citocromo oxidasa histoquímica e inmunohistoquímica de proteínas específicas de tipo celular.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cytochrome oxidase staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c from equine heart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1827</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antigen retrieval&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td><td>Carl Roth</td><td>4984.3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>TRITON-X 100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunohistochemistry&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000347</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000340</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V, biotin free</td><td>Carl Roth</td><td>0163.4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mounting or freezing media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (immunofluorescence)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt (histochemistry)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03989</td><td></td></tr><tr><td>Tissue freezing medium</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0696746</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Alcohol dehydration&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Carl Roth</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Carl Roth</td><td>P075.3</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752.4</td><td></td></tr><tr><td>Xylene substitute</td><td>Fluka</td><td>78475</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Devices/tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 650V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jung RM2035</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps - Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Bone Shears - 24 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>16150-24</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors - Large Loops</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Fine Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices

La corteza del cerebro mamífero es parcellated en distintas subestructuras o módulos. Módulos corticales normalmente mienten paralelos a la lámina cortical y pueden estar delineados por ciertos métodos histoquímicos e immunohistochemical. En este estudio, podemos destacar un método para aislar la corteza del cerebro mamífero y aplanar para obtener URL de secciones a la hoja de la cortical. Lo más resaltado seleccionado histoquímicos y aplanado de métodos inmunohistoquímicos para procesar estas secciones tangenciales para visualizar los módulos corticales. En la corteza somatosensorial de varios mamíferos, realizamos histoquímica de la citocromo oxidasa para mostrar mapas de cuerpo o módulos corticales que representan diferentes partes del cuerpo del animal. En la corteza del entorhinal medial, un área donde se generan las células de la red, utilizamos métodos inmunohistoquímicos para resaltar módulos de neuronas genéticamente determinadas que se arreglan en un patrón de cuadrícula en la hoja de cortical a través de varias especies. En general, ofrecemos un marco para aislar y preparar layer-wise aplanado secciones corticales y visualizar los módulos corticales mediante histoquímica y métodos inmunohistoquímicos en una amplia variedad de cerebros mamíferos.

Obtenidos de las secciones corticales aplanadas de la corteza somatosensorial en una variedad de cerebros y procesado por histoquímica de la citocromo oxidasa visualizar los módulos somatotópicos representando partes del cuerpo diferentes. Este enfoque comparativo permite estudiar las fuerzas evolutivas forma la corteza, por ejemplo, mostrando muy conservada representación de mistacial vibrissae en roedores y lagomorfos como barriles21 (<strong class="...

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Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Este artículo describe una metodología detallada para obtener secciones tangenciales aplastadas de cortezas mamíferas y visualizar los módulos corticales mediante histoquímica y métodos inmunohistoquímicos.

Visualización de módulos corticales en cortezas mamíferos aplanados

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K vistas.  Humboldt University of Berlin. Este artículo describe una metodología detallada para obtener secciones tangenciales aplastadas de cortezas mamíferas y visualizar los módulos corticales mediante histoquímica y métodos inmunohistoquímicos.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Investigación

Neurociencias

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

Cómo medir plegable cortical a partir de imágenes MR: un tutorial paso a paso para Calcular Índice Gyrification Local

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Medicina

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Ca Cortical Multi-capa<sup&gt; 2+</sup&gt; Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Comportamiento

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopía Multiphoton de cerebro de ratón Borrado Expresando YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Imágenes in vivo de Deep capas corticales con un microprisma

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Biología

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modificación de un Colliculo-tálamo-cortical del ratón Cerebro Loncha, incorporación de la impresión 3-D de la Cámara Componentes e Imagen óptica multi-escala

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain

Source: Slater, B. J., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53067">Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2015)
The video demonstrates the preparation of colliculo-thalamocortical brain slices from mouse pup brains. An isolated brain is aligned on a marked slide and cut at an angle to align the auditory midbrain and forebrain in the same plane. The brain is then sliced using a vibratome, and the slices containing the major auditory midbrain and forebrain structures are transferred to a holding chamber for preservation.

Preparación de cortes colínculo-talamocorticales a partir del cerebro de un cachorro de ratón

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation for and Removal of ...