この作品は、神経変性疾患 (DZNE) は、ドイツ連邦教育省および研究 (BMBF、Förderkennzeichen の zu ベルリンのフンボルト大学, 計算の神経科学のベルリンのための Bernstein の中心, ドイツ語センターによって支えられました。01GQ1001A)、NeuroCure とゴットフリート ・ ヴィルヘルム ・ ライプニッツ賞 DFG。優れたグラフィック デザインの平石山とユリアーネ Diederichs の優秀なテクニカル サポートに感謝します

すべての実験の手順は、ローカル倫理委員会 (LaGeSo) の監督の下で動物福祉に関するドイツのガイドラインに従って行われました。人間バット脳データはナウマンらから派生した、5雄 Wistar ラットに次の手順を実行 (ひずみ: RJHan:WI)。
1. 血流と脳領域抽出
注: 既存固定と血液-無料脳を得るために動物の transcardial 潅流推奨されています、残血は染色中に非特異的バック グラウンド信号を増加。それにもかかわらず、それも非灌流標本からフラットなセクションを取得し、それらを染色可能です。試料の取り扱いの容易さは、使用される定着剤の濃度によって異なります。あまり固定の平坦化、切削、高すぎる濃度平坦化のための柔軟性と染色の信号の品質を下げるしながら脳への損傷のリスクが高まります。
<ol><li>Transcardially は、23 G 針を使用して、動物を灌流します。詳細なガイドは、ゲージらを参照してください。9<ol>
<li>リン酸バッファー生理食塩水10 (PBS; 0.02 M; pH 7.4) 脳と動物の体から血を洗い流すために使用します。注入液が明確な少なくとも 150 ml の PBS 血管系を介して注入されて表示されるまで続行します。 注: 最良の結果が灌流されている動物の生理的血圧の範囲に類似した圧力で達成が (例えばラット: 120-130 mmHg)。必要に応じて、血液凝固11を避けるためにソリューションにヘパリン (10 U/mL) を追加します。</li>
		<li>脳を修正する transcardially を吹き込む 100 mL パラホルムアルデヒド12の最小値 (4 %pfa で 0.1 M のリン酸バッファー (PB)13) 動物の首が硬いまで。 注意: PFA は、潜在的な発がん性物質です。 注: 組織化学的活性染色、チトクロム酸化酵素などのように最高の結果を達成、2% を使用する場合 PFA。他の染色、免疫組織化学など 4 %pfa が好ましい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>頭蓋骨から脳を抽出します。 注: 表示計ら詳細については9 。<ol>
<li>大きなはさみまたは骨鋏を使用して頭を分離します。</li>
		<li>良いはさみを使用して鼻に首から正中線に沿って皮膚をカットしました。頭蓋骨を公開する肌を離れて引っ張る。首と罰金のはさみを使用して筋を削除します。</li>
		<li>頭頂骨まで後頭から始まって interparietal の骨を切って正中線を作る。</li>
		<li>Interparietal 骨をはがすには、Rongeurs を使用します。矢状縫合線に沿って高級ハサミをスライドさせ、頭頂の後端から、頭骨の前方の端にカットします。</li>
		<li>頭頂と頭骨をはがす、Rongeurs を使用します。また、鉗子を使って骨を持ち上げて取り外します。スプーンを使用して、腹側神経索を切断して脳を外します。脳を PB (0.1 M; pH 7.4) に転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4% 浸漬によって非灌流脳を修正 4 ° C で 1-3 h の PFA (脳の大きさとプローブによって: じゃじゃ馬: ~ 1 h、人間: 〜 3 h)。 : 注大規模な人間のような gyrencephalic 脳分離固定時間を減らすために関心のある領域を切り取ると。</li>
	<li>セクションで大きな皮質領域を得るためには、さらに後固定; する前に脳を平らにします。手順 2 に進みます。内側嗅のような領域に到達するための困難のセクションを取得する修正 4% 脳後手順 2 に進む前に 24 h の PFA。</li>
</ol>2. 脳の解剖と平坦化
<ol><li>かみそりの刃 (lissencephalic 頭脳) またはメス (gyrencephalic 脳) を使用して脳の半球を区切ります。 注: 脳を後解決されていない場合、処理による損傷を受けやすいです。</li>
	<li>以降のセクションの登録と収縮の推定を支援するための省略可能な手順:<ol>
<li>35 G 針は皮質表面に垂直で、非金利部皮質を穿刺します。2 回皮質シートに沿って定義された距離で手順を繰り返します。皮質のシートに沿った距離を決定するため (例えば、5 mm) 固定長でカット済みスレッドを使用し、穿刺のポイントを決定する大脳皮質の表面に沿ってレイアウトします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lissencephalic 脳: 解離性ヘラを使用して皮質下構造を削除します。重要: 脳の全体の手順中 PB (0.1 M; pH 7.4) と潤いを保ちます。<ol>
<li>小脳に脳を保持、脳梁で郭清の面を開くにヘラをゆっくり挿入します。ヘラの先丸は、大脳皮質から指摘しなければなりません。</li>
		<li>さらにヘラをスライドさせ、へらは視床と皮質の間まで丁寧に引き抜きます。動を傷の独立した皮質下構造。</li>
		<li>でも厚さの半球を検査します。 注: 任意の不均一な領域のトランス レイヤー グラデーションに断面中とあります。接線断面、脳をきれいにカットをする接線方向のセクションを希望する地域の軟膜表面に平行にメスを使用します。</li>
		<li>統合化の品質を改善するためにオプションの手順:<ol>
<li>横方向領域の皮質の厚さは増加するので、線条体、側坐核、眼窩前頭皮質、きれいにカットをします。また、皮質の内側部分の展開を可能にする前頭前野の内側の領域の基地で緩和のカットを追加します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>スライド ガラスの半球 (前野下向き) を配置します。2.6 の手順に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gyrencephalic 脳: 下前を展開する白質を削除 (詳細なプロトコルを参照してください: 染色ら14;Tootell、シルバーマンの15)。重要: 使用 PB (0.1 M; pH 7.4) 脳を湿った保つことすべての時。<ol>
<li>上向き皮質と大型ペトリ皿で湿らせたろ紙に関心のある分野を置きます。</li>
		<li>クモ膜と 2 つの鉗子を使用して pia を取り外します。</li>
		<li>湿った綿棒を使用して、優しく脳回の間の癒着をデタッチするそれぞれの溝に挿入します。</li>
		<li>別の湿らせたろ紙を使用して脳を好転します。</li>
		<li>1 つの脳回を展開するのに 2 つの湾曲したマイクロ ヘラを使用します。回の凹面の端に到達するまで離れて白質をいじめるにヘラの凸側を使用します。湿った綿棒を使用して、前回の凹面の端に達する旋回運動に進みます。</li>
		<li>離れて 1 つの脳回をいじめます。必要であれば、テンションが高すぎる場合にカット小さな緩和を追加します。</li>
		<li>ペトリ皿または類似のコンテナーに展開された脳を平らにします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>地域乾かさないように、フィルター紙のスポンジに大きな脳を必要に応じて、配置します。</li>
	<li>両側に粘土の 2 つの圧延作品を配置します。重大: 粘土の厚さどのくらい半球を平坦化することが定義されているように、粘土が 10-20% である非平坦化された皮質よりも薄い。</li>
	<li>半球が完全にフラットになるまでに大脳皮質を軽く第 2 ガラス スライド/小さなシャーレを押してください。目的の地域の最高の結果を得るためには、それぞれの区域の最初ガラス スライドを配置します。Lissencephalic 脳の最良の結果を得るためには、まず外側部分にスライド ガラスを接線方向配置し、この地域に集中して圧力をかけます。</li>
	<li>ガラス スライド/シャーレに (例えば、セラミック時計ガラス) 体重をかけるし、PB の 4 ° C で 3-5 h の半球を平らに。</li>
	<li>ポスト固定圧力を解放し、ガラス スライドを削除します。4 ° C でシェーカーの PFA (浮遊) に 24 h の平たい半球を置く 注: 1% を使用する場合、組織化学的活性染色の最良の結果を達成、PFA。他の染色、免疫組織化学、非灌流脳、PFA を使用ことができます 2% など。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> 図 1: ラット大脳皮質半球と体性感覚野におけるモジュールの可視化の平坦化のためのワークフローの略図。マウスの脳の解剖 transcardial 潅流後 (A)。皮質下構造除去し、皮質のリン酸バッファー (B) の 2 つのガラス スライド間フラット化されました。平たい半球 (C) だった後固定、接線方向断面およびチトクロム酸化酵素活性 (D) のステンド グラスします。スケール バー = 1 cm。 r: c: Caudal Rostral l: 横、m: 内側。Lauer 氏らから適応図23<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
3. 切削接線セクション
注: プロトコルを汚すの要件に応じて切削手順と厚み合わせることができます。80-150 μ m でさらに組織化学的処理 (手順 3.2) の半球をカットする、vibratome を使いました。ただし、免疫組織化学的処理薄いセクションが望まれ、凍結ミクロトームを用いて断面 (3.3) でステップ 10-60 μ m。ビデオ 1を参照してください。
<ol><li>PB でフラットな半球を洗う (0.1 m; pH 7.4) 15 分。</li>
	<li>Vibratome に半球をカットします。<ol>
<li>半球をスライス ホルダーに接線方向に配置します。必要に応じて、もう一度を押します (例えば、瞬間接着剤で) の位置に固定する前にスライド グラスで軽く。 注: は、平面的な半球の小さい厚さのため切削アイテム可能性がありますので接着剤の使用量を最小化します。</li>
		<li>必要な厚さに薄く終盤 (前方、後方はこちら) より厚くより安定した端から半球をカットします。3.4 の手順に進みます。 注: 固定の低濃度が使用された場合遅い速度と高振幅でカットします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>凍結ミクロトームに半球をカットします。<ol>
<li>Cryoprotect まで (PB) で 30% ショ糖溶液に浸漬することによって脳は沈みます。 注: cryoprotected をされている組織のサイズ、に応じてソリューションに沈むまで数時間から数日。大きな脳の代替に対する凍害保護作用方法が考えられる (Roseneらを参照してください。16)。</li>
		<li>氷の脳をマウントする凍結ミクロトームの基本を形成します。凍結ミクロトームのブロックの顔に PB を凍結して氷の基本を構築します。重要: は、氷の基地の表面はミクロトームの刃に平行を確認します。これを行うには、空の氷をミクロトームの刃を使用して切削表面に平行氷の基地が正確に整列するは基本のカットに。</li>
		<li>凍結中の脳を埋め込み、ブロック面に平行の関心の領域にミクロトームのブロックの顔にそれをマウントします。ミクロトームのブロックの顔に向かって脳の軟膜表面に直面します。重要: サンプル サイズに応じて凍結温度を調整します。高い温度は、断面中より良いセクションの整合性を確保するが、大きいセクションには、サンプルを均一に固定するのには低温が必要があります。</li>
		<li>接線方向 (セクションの最高品質、低速かつ一定の切削速度) 必要な厚さで脳をカットします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PB のシェーカーで 15 分間のセクションを洗います。</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> ビデオ 1: 接線断面ラット内側嗅と parasubicular と嗅内皮質モジュールのレイアウトからのスケマティック ビデオ。齧歯動物の脳の内側嗅皮質の後部の端にある、内側と腹側に向かって傾いています。接線方向のセクションを取得するには、この角度でナイフを定位します。その結果、適切な細胞型特異染色内側嗅と隣接する parasubiculum のモジュラー構造を明らかにします。ビデオ レイとブレヒトの8から適応。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
4. チトクロム酸化酵素染色を用いた皮質モジュールの可視化
注: 異なるプロトコルを汚すウォン ライリー17 例えば、チトクロム酸化酵素活性の組織化学的検出のため開発され Divacらによって後で変更18このプロトコル Divacらによるものに基づいて18、硫酸ニッケル アンモニウム (NiAS) を使用するのでより高いコントラストと汚された皮質領域でより良い定義されたモジュールの結果します。
<ol><li>チトクロム酸化酵素染色液の準備 (Divacらを参照してください。18). 溶液 10 mL、追加: 10 mL HEPES 緩衝液 (pH 7.4 0.1 M) 400 mg ショ糖、12.5 mg、ニアス 2 mg シトクロム C、6 mg ジアミノベンジジン (軽打)。 注意: DAB とニアス発癌性があります。 注: セクションの孵化直前に軽打を追加します。</li>
	<li>15 分のシェーカーに HEPES 緩衝液 (0.1 M、pH 7.4) のセクションを洗います。</li>
	<li>シェーカーで室温で染色液でセクションを孵化させなさい。 注: は、染色速度を観察します。目に見える反応がない場合は 37 ° C で培養に変更します。固定量に応じて染色観察できますまたはいくつかの時間で 10 分後。</li>
	<li>4% の追加によって反作用を停止 PFA;不要な再死ぬとバック グラウンド信号の増加がなくなります。</li>
	<li>HEPES 緩衝液を使用して 10 分の 3 つのセクションを洗います。</li>
	<li>マウントし、スライド ガラス上のセクションを乾燥します。</li>
	<li>増加のアルコール行とセクションを脱水します。<ol>
<li>80% エタノールで、96% のエタノールでスライドを洗う 1 分 2 分 3 分 5 分 5 分のキシレンでスライドを洗うためにイソプロパノールでスライドを洗うために 100% エタノールでスライドを洗うためのスライドを 1分間洗浄 60% エタノールでスライドに洗ってください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すぐに、迅速な硬化取付中と観察を追加します。重要: はニアスが洗い流される染色が低下すると、この水ベース マウント メディアは使用しないでください。</li>
	<li>長期的なストレージ 4 ° C でのセクションを保ちます。</li>
</ol>5. 免疫組織化学染色を用いた皮質モジュールの可視化
注: 複数のプロトコル、免疫組織化学、最適な試料とプローブの種類にことがあります。適応を行うことができます必要に応じて、さまざまな濃度の抗体、構造のエージェント、およびインキュベーション時間によって。次のプロトコルは、蛍光プローブによる抗体と可視化の広い範囲を検出するための良い結果に します。
<ol><li>15 分間 (0.1 M; pH 7.4) PBS のセクションを洗います。</li>
	<li>オプション: (焦らに基づく水槽を併用したエピトープの正体を暴露する抗原検索を実行します。19;代替方法は、Pileriらを参照してください。20)。<ol>
<li>80 ° C の水浴を予熱します。三ナトリウム クエン酸バッファー19 (pH 8.0) を準備し、80 ° C の水浴で予熱</li>
		<li>セクションをトライ ナトリウム クエン酸バッファーに転送します。80 ° C で 30 分のセクションを孵化させなさい</li>
		<li>部屋の温度の下にセクションを冷却します。</li>
		<li>15 分のための PBS でセクションを洗います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 回で PBS X セクションを洗う (0.5 %0.1 M PBS でトリトン X) 15 分。</li>
	<li>2 h のウシ血清アルブミン (BSA; 2.5%) とトリトン X (0.75%) を PBS でのソリューションのセクションの孵化によって不明確なエピトープをブロックします。</li>
	<li>一次抗体を例えばカルビンジン-D28k のセクションを孵化させなさい (1:5, 000 PBS x 1 %bsa)、4 ° C でシェーカーの 2-3 日間 注: 一次抗体の希釈使用特定の抗体に依存します。特定の抗体の希釈条件を入手する製造元の情報を参照してください。複数の抗体は一緒に使用することができますが、別の種に対して提起する必要があります。</li>
	<li>3 回 15 分 PBS でセクションを洗います。</li>
	<li>二次抗体 (1: 200、PBS で 1 %bsa) シェーカーの 4 ° c で一晩セクションを孵化させなさい。 注: 複数の二次抗体は複数の一次抗体を使用した場合、異なるスペクトルで使用できます。</li>
	<li>3 回 10 分ずつの PBS でセクションを洗浄することにより二次抗体を洗浄します。</li>
	<li>マウント、顕微鏡用スライド ガラス上のセクションを乾燥します。 注: セクションは、coverslip をマウントする前に湿ったはずです。</li>
	<li>組織切片を蛍光染料に適したメディアをマウントを適用し、観察を適用します。</li>
	<li>1 h のセクションを乾燥させます。</li>
	<li>長期的なストレージ、マニキュアを使用 coverslip のシールし、4 ° C で暗闇の中で保持</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brodmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).</li><li>Naumann, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reptilian+brain.">The reptilian brain.</a> Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).</li><li>Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+columns,+modules,+and+domains+in+the+neocortex+of+primates.">Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).</li><li>Woolsey, T. A., Van der Loos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+organization+of+layer+IV+in+the+somatosensory+region+(SI)+of+mouse+cerebral+cortex:+the+description+of+a+cortical+field+composed+of+discrete+cytoarchitectonic+units.">The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units.</a> Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).</li><li>Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+size+and+periodicity+of+pyramidal+patches+in+layer+2+of+medial/caudal+entorhinal+cortex.">Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex.</a> J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).</li><li>Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grid-layout+and+theta-modulation+of+layer+2+pyramidal+neurons+in+medial+entorhinal+cortex.">Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex.</a> Science. 343 (6173), 891-896 (2014).</li><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+oxidase:+an+endogenous+metabolic+marker+for+neuronal+activity.">Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity.</a> Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).</li><li>Ray, S., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+development+and+dorsoventral+maturation+of+the+medial+entorhinal+cortex.">Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex.</a> Elife. 5, e13343 (2016).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate-buffered+saline+(PBS).">Phosphate-buffered saline (PBS).</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).</li><li>Olson, S. T., Chuang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+activates+antithrombin+anticoagulant+function+by+generating+new+interaction+sites+(exosites)+for+blood+clotting+proteinases.">Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases.</a> Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+(PFA;+4%).">Paraformaldehyde (PFA; 4%).</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+phosphate+(PB).">Sodium phosphate (PB).</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).</li><li>Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+flatmounting+of+the+macaque+cerebral+cortex.">Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex.</a> Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).</li><li>Tootell, R. B., Silverman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+for+flat-mounting+cortical+tissue.">Two methods for flat-mounting cortical tissue.</a> J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).</li><li>Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryoprotection+method+that+facilitates+cutting+frozen+sections+of+whole+monkey+brains+for+histological+and+histochemical+processing+without+freezing+artifact.">A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact.</a> J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).</li><li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry.">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).</li><li>Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., L&#243;pez-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., M&#248;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+contrast+in+histochemical+detection+of+cytochrome+oxidase:+metallic+ions+protocol.">Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol.</a> J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+sensitive+antigen+retrieval+method+for+free-floating+and+slide-mounted+tissue+sections.">A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections.</a> J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).</li><li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).</li><li>Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomical+studies+of+the+SmL+face+cortex+with+special+reference+to+the+occurrence+of+"barrels"+in+layer+IV.">Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV.</a> J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).</li><li>Krubitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+neocortex+in+mammals:+are+species+differences+really+so+different?.">The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different?.</a> Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).</li><li>Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+selected+size+differences+and+conserved+sexual+monomorphism+of+genital+cortex.">Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex.</a> J Comp Neurol. , (2017).</li><li>Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+bundles+of+dendrites+in+the+neocortex.">Vertical bundles of dendrites in the neocortex.</a> Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).</li><li>Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+trajectories+between+mouse+somatosensory+thalamus+and+cortex.">Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex.</a> J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).</li><li>Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+Modular+Microcircuits+of+the+Rat+Medial+Entorhinal+Cortex.">Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex.</a> Front Syst Neurosci. 11, (2017).</li><li>Livingstone, M. S., Hubel, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+inputs+to+cytochrome+oxidase-rich+regions+in+monkey+visual+cortex.">Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).</li><li>Land, P. W., Simons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+oxidase+staining+in+the+rat+SmI+barrel+cortex.">Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex.</a> J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).</li><li>Welker, C., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+layer+IV+in+the+somatosensory+neocortex+of+the+rat:+description+and+comparison+with+the+mouse.">Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse.</a> J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).</li><li>Retzius, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Cajal'schen+zellen+der+grosshirnrinde+beim+menschen+und+bei+s&#228;ugetieren.">Die Cajal'schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei s&#228;ugetieren.</a> Biol Unters. 5, 1-9 (1893).</li><li>Cajal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des vert&#233;br&#233;s. , (1911).</li><li>Chapin, J. K., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+body+representation+in+the+SI+cortex+of+anesthetized+and+awake+rats.">Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats.</a> J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).</li><li>L&#246;wel, S., Freeman, B., Singer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+the+orientation+column+system+in+large+flat-mounts+of+the+cat+visual+cortex:+A+2-deoxyglucose+study.">Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study.</a> J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+rat+parasubiculum.">Functional architecture of the rat parasubiculum.</a> J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).</li><li>Snyder, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Map projections--A working manual (Vol. 1395). , (1987).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li></ol>

著者らは、調査した潜在的な利益相反として解釈される可能性が商業や金融関係の不在を宣言します。

大脳皮質のモジュールは、さまざまな技術を使用して識別されています。早いいずれかの可視化による研究通常識別される皮質モジュール セルの密集した地域または繊維1の不在。それ以降のメソッドは、有無樹状束24、25の特定の領域からの求心性神経の神経伝達物質26の充実に活用しています。ここで 2 つの技術、(i) ?...

大脳皮質における系統間の頭脳の構造の最も重要な変更のいくつかを観察できます。重要な違いにもかかわらず動物の大脳皮質共通パターンに従います、レイヤーとエリア1では 2 つの異なる方法で大きく分類されます。皮質層はそこに脳の表面に平行と哺乳類の皮質1で 6 層に爬虫類野2の 3 レイヤーの数が異なります。皮質は一方で主など個別の機能に対応する大脳皮質の異なる領域、体性感覚野はタッチや視覚入力の処理の視覚皮質の感覚に関与します。これらの皮質頻繁に分割できますパッチまたはモジュール3、解剖学的構造は、基本的に脳の軟膜の表面に平行を見つけては繰り返し定期的にします。皮質モジュールが特定のレイヤー4に限られることがあります。 またはいくつかのレイヤー5に 。
脳の標準断面方法は、コロナや矢のような脳の表面に正常のセクションを含みます。皮質モジュールを可視化するこれらのメソッドを使用できますが、皮質のモジュールは、脳の表面に平行な平面で接線方向、視覚化されたときは、興味深い機能の多くを明らかになることができます。例えば、脳表面に垂直に視覚化されたときバレルとしてひげを表す齧歯動物の脳の体性感覚のモジュールが表示され、従って地域派生名バレル皮質。ただし、接線方向にバレルの視覚化の彼らは外部の体表面のひげの正確なレイアウトをミラーリング地形向きで配置されてバレルとウィスカ マップを明らかに。特定のケースでモジュール式の配置はかなりの期間のための検出をエスケープも非接線方法で視覚化されたとき。内側嗅は、グリッド セル、動物が環境を走査するとき規則的な六角形パターンで発射するニューロンの存在を知られています。にもかかわらず、最近では、パッチの有無や内側嗅細胞のモジュールまで大きく調査エリアは、6の六角形のパターンでレイアウトする物理的に検出を逃れていた。プレゼンスおよびラット脳におけるこれらのモジュールの配置は、内側嗅の接線方向のセクションを作ると、細胞構築を層ごとに調査によって促進されました。
断面後、皮質モジュールの可視化の特定の側面は、複数の方法で実現できます。従来、研究細胞密度や繊維レイアウト1に基づいてモジュールの輪郭を描いた。高い活動8の領域を明らかにするチトクロム酸化酵素組織化学を使用する人気のある方法です。新しいアプローチは、遺伝的に決定細胞型のタンパク質発現プロファイル6,8に基づいて区別を見ています。
この研究では、哺乳類の脳の皮質を分離、平面的な接線方向のセクションを取得およびチトクロム酸化酵素組織化学および細胞型特定の蛋白質の免疫組織化学に基づいて大脳皮質のモジュールを可視化する方法を強調表示します。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cytochrome oxidase staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c from equine heart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1827</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antigen retrieval&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td><td>Carl Roth</td><td>4984.3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>TRITON-X 100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunohistochemistry&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000347</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000340</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V, biotin free</td><td>Carl Roth</td><td>0163.4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mounting or freezing media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (immunofluorescence)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt (histochemistry)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03989</td><td></td></tr><tr><td>Tissue freezing medium</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0696746</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Alcohol dehydration&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Carl Roth</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Carl Roth</td><td>P075.3</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752.4</td><td></td></tr><tr><td>Xylene substitute</td><td>Fluka</td><td>78475</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Devices/tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 650V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jung RM2035</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps - Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Bone Shears - 24 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>16150-24</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors - Large Loops</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Fine Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices

哺乳類の大脳皮質は異なる部分やモジュールに parcellated です。皮質モジュールは通常そこに皮質のシートを平行し特定の組織化学的および免疫組織化学的方法で線引きすることができます。この研究では、哺乳類の脳の皮質を分離し、皮質のシートに平行にセクションを取得するそれらを平坦化する方法を強調表示します。さらに、組織化学的選択したハイライト、これらを処理する免疫組織化学的方法は、皮質モジュールを可視化する接線方向のセクションを平坦化します。各種哺乳動物の体性感覚皮質では、体表や動物の体のさまざまな部分を表す皮質モジュールを明らかにするチトクロム酸化酵素組織化学的研究を実行します。内側内嗅領皮質、グリッド セルの生成場所、領域は皮質のシートにグリッド パターンのいくつかの種の間で整理される遺伝のニューロンのモジュールを強調表示する免疫組織化学的方法を駆使します。全体的にみて、分離し、layer-wise を準備するためのフレームワーク皮質のセクションを平坦化、化学を用いた皮質モジュールとさまざまな哺乳類の脳での免疫組織化学的方法を視覚化を提供いたします。

様々 な脳の体性感覚野の皮質のセクションを平らを, チトクロム酸化酵素組織化学別の身体の部分を表現するシミュレーション モジュールを可視化するためにそれらを処理します。この比較のアプローチにより、その形状野、例えば、齧歯動物および兎のバレル21 (図 2) mystacial ヒゲの非常に節約された表現を示す進化の...

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Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

この記事では、哺乳類の皮質から接線方向の平坦化されたセクションを取得し、皮質モジュールによる組織化学的および免疫組織化学的方法を視覚化する詳細な方法について説明します。

平坦化された哺乳類の皮質皮質モジュールの可視化

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

visualization-of-cortical-modules-in-flattened-mammalian-cortices

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K ビュー.  Humboldt University of Berlin. この記事では、哺乳類の皮質から接線方向の平坦化されたセクションを取得し、皮質モジュールによる組織化学的および免疫組織化学的方法を視覚化する詳細な方法について説明します。

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

神経科学

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

ローカルGyrificationのインデックスを計算するステップバイステップのチュートリアル：MR画像からの皮質折りたたみを測定する方法

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

医学

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

多層皮質Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;プリズムプローブと小型蛍光顕微鏡を用いて自由に動くマウスのイメージング

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

行動学

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

YFPを発現クリアマウス脳の多光子顕微鏡

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

マイクロプリズムを使ってDeep皮質層のin vivoイメージング

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

生物学

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

商工会議所のコンポーネントとマルチスケール光イメージングの3次元印刷を組み込むColliculo、視床皮質マウス脳スライスの変更、

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

視床皮質軸索分岐とシナプスの可視化脊髄共培養系における形成

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain

Source: Slater, B. J., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53067">Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2015)
The video demonstrates the preparation of colliculo-thalamocortical brain slices from mouse pup brains. An isolated brain is aligned on a marked slide and cut at an angle to align the auditory midbrain and forebrain in the same plane. The brain is then sliced using a vibratome, and the slices containing the major auditory midbrain and forebrain structures are transferred to a holding chamber for preservation.

マウスの子犬の脳からの視床皮質スライスの調製

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation for and Removal of ...