Die Autoren danken V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger und K. Svoboda aus dem Genetisch-Encoded Neuronal Indicator und Effector (GENIE) Projekt am Janelia Research Campus des Howard Hughes Medical Institute für ihre großzügige Spende von AAV1-GCaMP6f Zur Universität von Pennsylvania Vector Core. Sie danken auch der A. Olson und Neuroscience Microscopy Core an der Stanford University, unterstützt von NIH NS069375 Grant für ihre konfokalen Mikroskopie Dienstleistungen.

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Die Autoren haben die Politik der Zeitschrift gelesen und haben folgende konkurrierende Interessen: SG, SO und VC sind bezahlte Mitarbeiter bei Inscopix.

Das Verständnis der neuronalen Kreislaufaktivität während des wachen Verhaltens ist ein wichtiges Niveau der neurowissenschaftlichen Untersuchung, die benötigt wird, um die Gehirnfunktion in Gesundheit und Krankheit wirksam zu sezieren. Die Kortex ist eine besonders wichtige Region, um im Kontext des wachen Verhaltens zu studieren, da sie in vielen lebenswichtigen sensorischen, kognitiven und exekutiven Funktionen eine wichtige Rolle spielt. 28 , 29 . Es wird angenommen, dass die kortikale Säule die grundlegende funktionelle Einheit in der Kortex ist und die Populationsaktivität von kortikalen Zellen auf der Grundlage ihrer physikalischen Lage innerhalb der Säule bekannt ist. Zum Beispiel projizieren exzitatorische Neuronen in Schichten 2/3 im somatosensorischen Kortex vorwiegend in andere neokortikale Regionen und modulieren andere kortikale Netzwerke 30 , während Zellen in tieferen Schichten primär zu subkortikalen Regionen wie dem Thalamus 31 projizieren. Aufzeichnung der Aktivität von hundertS von vordefinierten kortikalen Zellen gleichzeitig und zuverlässig über die Zeit über verschiedene Lamina in frei verhaltenden Themen würde unser Verständnis des kortikalen Informationsflusses erheblich vorantreiben, was eine feinere funktionelle Dissektion von kortikalen Säulen ermöglicht, die durch Echtzeit-Verhaltensinformationen und aufgabenrelevante Zeit- Waage. Das Sammeln dieses Niveaus der neuronalen Schaltungsdaten wird durch die Verwendung einer effizienten und stromlinienförmigen miniaturisierten Mikroskopieplattform ermöglicht, um eine großformatige Ca 2+ -Bildgebung in frei verhaltenden Probanden (oder kopffesten Themen wie gewünscht) durchzuführen. Verwendet mit genetisch codierten Calciumindikatoren, um zelltypspezifisches Targeting zu ermöglichen und ein mehrschichtiges Sichtfeld, das von einer chronisch implantierten Prismensonde bereitgestellt wird, zu untersuchen, untersuchte dieses Protokoll einen Fall unter vielen möglichen Anwendungen: Beobachten von laminaren Unterschieden in der somatosensorischen kortikalen Verarbeitung bei Mäusen Physisch mit einem neuartigen Objekt beschäftigt (Abbildung 5 ).Dies ist die erste prozedurale Darstellung dieser Art von zelltypspezifischen, in vivo- Ansatz, um mehrere kortikale Schichten in wachen, frei verhaltenden Tieren zu untersuchen und erweitert das Spektrum der experimentellen Methoden, um Laminarstrukturen im aktiven Gehirn zu verstehen. Das periskopische Sichtfeld, das durch die Prismensonde in dieser Technik ermöglicht wird, kann auf andere Hirnstrukturen angewendet werden, wenn die Erhaltung des Gewebes, das direkt zu einem interessierenden Bereich dorsal ist, erwünscht ist; Zum Beispiel konnte CA3-Bildgebung ohne Unterbrechung der Hippocampus-Funktion erreicht werden. Der prisma-basierte Ansatz zur Abbildung der Ca 2+ -Aktivität erfordert die physikalische Insertion und permanente Implantation eines Mikroprismas in die Kortikalis, was der Entstehung einer kortikalen Läsion entspricht, bei der die Linsensonde eingesetzt wird. Dies kann zu Störungen der lokalen neuronalen Schaltungen führen, einschließlich der Trennung von apikalen Dendriten und Prozessen. TSeine Prozedur wird auch eine anfängliche Aktivierung von Gliazellen in der Region verursachen, obwohl dies erwartet wird, dass sie auf das Gewebe etwa 150 &amp; mgr; m von der Prismenfläche lokalisiert werden, und um nach dem Gehirn zu verhärten 22 . Es ist sehr wichtig zu prüfen, ob diese Technik die normale Schaltkreisanatomie und / oder das Verhalten der Tiere bei der Planung von Experimenten beeinflussen wird. Behavioral Control Groups sollten immer durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass es keine signifikanten Veränderungen in Baseline-Verhaltensweisen, die zu verletzenden experimentellen Ergebnissen führen könnte. Mit dieser miniaturisierten, mobilen Ca 2+ Imaging-Technik mit neuropharmakologischer Manipulation können verschiedene kognitive, soziale, motorische oder intrinsische Verhaltensparadigmen kombiniert und mit anderen physiologischen Metriken kombiniert werden, um Studien zu vertiefen und zu bereichern, die auf das Verständnis der funktionellen Rollen von neuronalen Schaltungen in Verhalten und Signal ausgerichtet sind Verarbeitung 32 . Unterdrückung oder AktivierungDie durch Medikamente moduliert werden, können die damit verbundenen Verhaltensweisen beeinflussen, die mit dieser Technologie leicht untersucht werden können 33 . Die Verzweigung in verschiedene Zelltypen durch die Änderung der Ausrichtung des Kalziumindikators ist eine weitere leistungsfähige und nützliche Anwendung und ermöglicht viele kreative Kombinationen von experimentellen Werkzeugen, um verschiedene neuronale Schaltungsfragen zu lösen.

Die Kortex ist ein wesentlicher Spieler in vielen komplexen mentalen und Verhaltensfunktionen, von der Aufmerksamkeit, der sensorischen Wahrnehmung und der top-down kognitiven Kontrolle 1 , 2 , 3 bis hin zu Motivations-, Belohnungs- und Suchtwegen 4 , 5 . Das Verständnis der Rechenprozesse, die seiner Funktion zugrunde liegen, ist ein wichtiges Ziel, ein besseres klinisches Verständnis vieler geistiger und Verhaltensstörungen zu erreichen. Viele gegenwärtige Theorien der psychiatrischen Erkrankung konzentrieren sich um die Idee, dass kortikale neuronale Kreislaufdysfunktion oder Diskoordination kognitiven und Verhaltensanomalien unterliegen können, die das Kennzeichen von Bedingungen wie Schizophrenie 6 , Autismus 7 oder Zwangsstörungen sind. So erhalten die Populationsniveau neuronale Aktivitätsdaten von coRtische Schaltungen innerhalb des richtigen Kontextes gleichzeitiger Verhaltensinformationen sind von großer Bedeutung und können idealerweise auf spezifische Zelltypen für eine feinere neuronale Schaltungsdissektion ausgerichtet sein. Miniaturisierte Mikroskope in Verbindung mit implantierbaren Gradientenbrechungsindex (GRIN) Mikrolinsen ermöglichen den optischen Zugang zu neuronalen Ensembles unter frei beweglichen Zuständen aus einer Vielfalt möglicher Hirnareale 9 , 10 , 11 , 12 , 13 einschließlich der Kortex 14 , 15 , 16 . Die Verwendung eines mobilen Mikroskopiesystems, das mit genetisch codierten Calciumindikatoren gekoppelt ist, ermöglicht eine konsistente Abbildung der gleichen zellulären Population, die Hunderte von Neuronen über Tage bis Wochen in vielen Hirnregionen 9 umfasst und kannGenetisch auf spezifische Zelltypen mit viralen Vektor oder transgenen Techniken gerichtet. Da die Kortex bekannt ist, verschiedene Funktionen zu unterstützen und sich in Abhängigkeit von der Lage der Zellen innerhalb der kortikalen Lamina 17 , 18 , 19 mit verschiedenen Hirnregionen zu verbinden, sind wir daran interessiert, eine gleichzeitige mehrschichtige neuronale Aktivität bei wachverhaltenden Probanden zu erhalten. Hier zeigen wir, wie man Hunderte von fluoreszenzbeschrifteten Neuronen in frei verhaltenden Mäusen über Tage bildt, wobei das miniaturisierte Fluoreszenzmikroskop 20 mit einer implantierten Prismensonde gepaart wird, die eine mehrschichtige Sicht auf die Kortikalis bietet (Abbildung 1 ). Die hier verwendete Prismensonde besteht aus zwei getrennten GRIN-Objektiven: einem Prisma und einer zylindrischen Relaislinse ( Bild 1 ). Das Licht aus dem Mikroskop erregt die fluoreszenzbeschriftetZellen, die sich entlang der Abbildungsfläche der Prismensonde befinden, nachdem sie von der Hypotenuse des Prismenabschnitts der Sonde reflektiert wurden. Das emittierte Licht aus den Zellen reflektiert auch die Hypotenuse des Prismas, wird durch das Ziel des Mikroskops gesammelt und erreicht den Sensor im Mikroskop. Die in diesem Verfahren verwendete Prismensonde eignet sich für den einfachen Gebrauch mit Standard-Stereotax-Ausrüstung. Das miniaturisierte Fluoreszenzmikroskop 20 detektiert aktionspotential-evozierte Ca 2+ -Transienten in neuronalen Populationen mit Einzelzell-Auflösung, nachdem diese Zellen spezifisch mit Ca 2+ -sensitiven genetisch codierten Fluoreszenzindikatoren markiert wurden. In diesem Protokoll injizieren wir den in einem viralen Vektor (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) codierten Ca 2+ -Anderindikator, implantieren eine Prismensonde, installieren das Mikroskop und erhalten dann mehrere Tage somatosensorische (s1 hintere Gliedmaßen) neuronale Aktivitätsdaten Von einem Tier aussetzenD zu neuartigen Objektoberflächen während der freien Exploration (Abbildung 2 ).

<table><tbody><tr><td>Neurostar Motorized&lt;br/&gt; Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td><td>Kopf</td><td>Model 963SD</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Labomed</td><td>Prima DNT</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&quot;/1.6 mm diameter) - 1/4&quot; Jack</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Heating Pad 5 X 12.5 cm&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>40-90-2-07</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>DC Temperature Controller</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Microsyringe Pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3 model; serial 155788 F110</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>NanoFil 10 &amp;mu;L Syringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF35BV-2</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Omnidrill35, 115 - 230 V</td><td>World Precision Instruments</td><td>503598</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Burrs for Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>nVista</td><td>Inscopix</td><td>100-001048</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-PV3435</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Victor Medical</td><td>5487</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Victor Medical</td><td>1699008&amp;nbsp;</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Victor Medical</td><td>1001054</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm)</td><td>Pfizer (Fisher Scientific)</td><td>NC9841478</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dissecting knives</td><td>Fine Science Tools</td><td>10055-12</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>ProView Implant Kit</td><td>Inscopix</td><td>100-000756</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm Length</td><td>Inscopix</td><td>100-000592</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Kwik-Cast Sealant</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Miniature Optical Mounting Post</td><td>Newport</td><td>M-TSP-3</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate</td><td>Inscopix</td><td>BPL-2</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate Cover</td><td>Inscopix</td><td>BPC-2</td><td>Imaging</td></tr></tbody></table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

In-vivo -Schaltung und zelluläre Ebene funktionale Bildgebung ist ein kritisches Werkzeug für das Verständnis des Gehirns in Aktion. Die hochauflösende Bildgebung von Mauskortikalen Neuronen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet einzigartige Einblicke in die kortikale Struktur, Funktion und Plastizität. Allerdings sind diese Studien auf Kopf feste Tiere begrenzt, stark reduziert die Verhaltenskomplexität zur Verfügung für die Studie. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Verfahren zur Durchführung einer chronischen Fluoreszenzmikroskopie mit zellulärer Auflösung über mehrere kortikale Schichten bei frei verhaltenden Mäusen. Wir verwendeten ein integriertes miniaturisiertes Fluoreszenzmikroskop, gepaart mit einer implantierten Prismensonde, um gleichzeitig die Kalziumdynamik von Hunderten von Neuronen über mehrere Schichten des somatosensorischen Kortex zu visualisieren und aufzuzeichnen, wie die Maus in einer neuartigen Objekt-Explorationsaufgabe über mehrere Tage hinweg. Diese Technik kann an andere Hirnregionen in verschiedenen Tierarten für andere Verhaltensweisen angepasst werdenAradigms

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt einen effektiven und effizienten Weg, um eine mehrschichtige Ca 2+ -Bildgebung von Hunderten von kortikalen Neuronen in frei verhaltenden Mäusen unter Verwendung von Prismensonden durchzuführen (Abbildung 1 ). Bisherige Ansätze zur mehrschichtigen kortikalen Bildgebung wurden in erster Linie auf kopffeste Tiere 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 beschränkt. Um diese Datenebene in einem frei verhaltenen Kontext zu erwerben, wurde eine miniaturisierte Mikroskopplattform für Verhaltensflexibilität eingesetzt; Ein genetisch codierter Calciumindikator (GCaMP6f) wurde verwendet, um eine spezifische Zellpopulation (CAMKII + Zellen in der Kortex) zu zielen; Und eine Prismensonde wurde gewählt, um ein chronisches, mehrschichtiges Gesichtsfeld zu schaffen. <p class="jove_content" fo:keep-dieIn-Seite = &quot;1&quot;&gt; Wir haben den Arbeitsablauf zur Vorbereitung des Tieres für die Bildgebung vorgestellt. Ein viraler Vektor, der für einen geeigneten Calciumindikator kodiert, wurde in den Kortex injiziert ( Fig. 2 , Schritt 1), bevor er eine Prismensonde chronisch implantiert, um einen optischen Zugang zu den markierten Zellen zu ermöglichen ( Fig. 2 , Schritt 2). Eine Basisplatte, die als sicheres, temporäres Dock für die Positionierung des Mikroskops während der Bildgebungssitzungen dient, wurde dann über dem Kopf des Tieres installiert (Abbildung 2 , Schritt 3), was die Visualisierung der kortikalen Aktivität über mehrere Zellschichten in einem wachen, das sich experimentell verhält, ermöglicht Setup ( Abbildung 2 , Schritt 4). Um sicherzustellen, dass die gewünschte zelluläre Population angestrebt wurde, ist in Abbildung 3 ein postmortiver koronaler Hirnabschnitt von einer repräsentativen Maus dargestellt, wobei der Prisma-Sonden-Trakt und das im Vergleich zum GCaMP6f-Labor markierte SichtfeldEeligen Neuronen in den Schichten 2/3 und 5 der somatosensorischen Kortex. Während des wachen Verhaltens mit dem System wurde die Aktivität der somatosensorischen kortikalen Neuronen aufgezeichnet, als die Maus drei verschiedenen Umgebungen ausgesetzt war - Open Field (Tag 1), Objekt-Vertrautmachung (Tag 2-4) und neuartiges Objekt (Tag 5) ( Abbildung 4 ). Am Tag 1 wurde die Maus in eine Verhaltensarena ohne irgendwelche Gegenstände gelegt. Am Tag 2-4 wurde die Maus in die Arena mit den gleichen zwei texturally verschiedenen Objekten (ein Gel-Pad und ein Holz-Block) platziert. Am 5. Tag wurde eines der Objekte durch ein neuartiges Objekt ersetzt. Das Tier wurde über 5 Tage für 20 min pro Tag abgebildet. Nach der Zellextraktion unter Verwendung der Ca 2+ Bilddatenanalyse-Software wurden räumliche Filter, die den Zellorten entsprechen, auf der mittleren Fluoreszenzintensitätsprojektion der Mikroskopaufzeichnungsdaten überlagert( Fig. 5) . Eine weiße gestrichelte Linie trennt die Schichten 2/3 und 5 Zellen. Entsprechende Ca 2+ Spuren aus 5 Zellen aus jeder der Schichten zeigen das Zündmuster der Zellen in zwei verschiedenen Verhaltenskontexten - Objektvertrautheit und neuartige Objektbelichtung. Schicht-2/3-Zellen waren im Vergleich zu Schicht-5-Zellen am Tag, an dem die Maus einem neuartigen Objekt ausgesetzt war, aktiver. Dies zeigt sich auch aus den Rasterplots, die an den Tagen 1, 4 und 5 die schwankende Zündaktivität aller abgebildeten Zellen zeigen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Abbildung 1: In vivo Ca 2+ Bildgebung über mehrere kortikale Schichten in frei beweglichen Mäusen. ( A ) Prismen-Sonden-Spezifikationen und Darstellung der Bilderzeugungsebene. Die reflektierende Beschichtung auf der Innenseite der Hypotenuse ermöglicht die Abbildung von 90 ° aus der Einsteckebene der Prismensonde. Die Linse cuFf integriert sich mit dem Linsenhalter, der das Implantationsverfahren optimiert und eine mögliche Betrachtung der Umgebungsgewebsfluoreszenz während der Implantation ( B ) (i) ermöglicht. Abbildung der Platzierung der Prismensonde Craniotomie und Messerinzision relativ zur Virusinjektionsstelle und (ii) Darstellung der Lage der Prismensonde flache Seite relativ zum Messereinschnitt und der Virusinjektionsstelle. ( C ) Darstellung des in-vivo Ca 2+ -Bildgebungsaufbaus, der den Lichtweg für einen kleinen Bereich innerhalb des vollen Gesichtsfeldes durch eine im Mauskortex implantierte Prismensonde zeigt. ( D ) Beispiel-Sichtfeld bei der Prisma-Sonde. Das Miniaturmikroskop ist an der Linsenhalterung befestigt, die die Prismensonde hält und die Überprüfung der Virusausdruck während der Prisma-Sonde ermöglicht. ( E ) Integration des Mikroskops mit Prismensonde zur mehrschichtigen kortikalen Bildgebung von GCaMP6f-markierten S1-Zellen. F Beispiel SichtfeldBei der Grundplatteninstallation. Klares Blutgefäßmuster ist zum Zeitpunkt der Basisplatte sichtbar mit einigen Zellen im Rohbild sichtbar. Weitere Zellen sind deutlich sichtbar, wenn DF / F im Fenster der Erfassungssoftware eingeschaltet ist. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Abbildung 2: Schematische Darstellung der Zeitleiste von Workflow-Ereignissen für Prisma-Sonden-Implantation und Mikroskop-Installation. Die Anzahl der Wochen ist auf der X-Achse und die Workflow-Schritte der Prozeduren entlang der Y-Achse dargestellt. ( A ) Grafische Darstellung der viralen Injektion (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) entlang der gleichen dorso-ventralen Achse, um mehrere Schichten der Maus somatosensorischen Kortex zu markieren. ( B ) 2 Wochen nach Virusinjektionen, ein PrismaproblemE wird an einer Achse implantiert, die parallel zu den Virusinjektionsstellen ist. ( C ) Ungefähr eine Woche nach der Prismensondenimplantation wird das Tier auf den Ausdruck mit dem Mikroskop überprüft und eine Basisplatte wird auf dem Kopf angebracht, wenn eine Population von Zellen sichtbar ist. ( D ) Das Tier ist dann für die chronische Bildgebung bei relevanten Verhaltensaufgaben bereit (Mausclip, modifiziert nach Genehmigung von - UW-Madison Biochemistry MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Abbildung 3: Postmortem Histologische Validierung der Prismensondenposition und GCaMP Expression. ( A ) Koronaler Abschnitt von einem repräsentativen Maus-Gehirn, das den Prismen-Sonden-Trakt zeigt und mit seiner bildgebenden SeiteDie GCaMP6f-exprimierenden Zellen (AAV1.CaMKII.GCaMP6f, ausgedrückt in Neuronen in den Schichten 2/3 und 5). ( B ) Gleiche koronale Hirnsektion nach Färbung für DAPI. Maßstab = 250 μm ( C ) Vergrößerte Ansicht von GCaMP6f-exprimierenden Zellen in somatosensorischem Kortex. Maßstab = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Abbildung 4: Mäuseaktivität während der Habituation, Vertrautmachung und neuartige Objektbelichtungstests wurde mit Video-Software aufgezeichnet. ( A ) Am Tag 1 wurde das Tier in eine Verhaltensarena ohne irgendwelche Gegenstände (Open Field) gestellt. ( B ) An den Tagen 2-4 wurden die gleichen zwei texturisch unterschiedlichen Objekte (Gel-Pad und Holzblock) in die Arena gelegt (Object FamiLilierung). ( C ) Am Tag 5 wurde eines der Objekte durch ein neuartiges Objekt (Holzblock mit Sandpapier) ersetzt (Novel Object Exposure). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Abbildung 5: Calcium-Dynamik von oberflächlichen und tiefen Schichten des somatosensorischen Cortex einer repräsentativen Maus mit dem Mikroskop abgebildet. ( A ) Zusammengeführtes Bild von neuronalen Raumfiltern (grüne Blobs) und mittlere Fluoreszenzintensitätsprojektion der Mikroskopaufnahme durch Prismensondenfeld. Grenze zwischen supragranularen und infragranulären Schichten, die durch eine weiße gestrichelte Linie dargestellt sind. Maßstab = 100 μm. ( B ) Calciumspuren aus fünf beispielhaften oberflächlichen und tiefen Schichtzellen (gefüllt blau und rot cElls in Panel A), Angabe von Einheiten der Standardabweichung der Fluoreszenz nach prinzipieller und unabhängiger Komponentenanalyse. Horizontale Skalenstange 50 s und vertikale Skalenleiste 10 SD ( C ) Rasterplot von Zellen aus oberflächlichen (Schichten 2/3) und tiefen Schichten (Schicht 5) gezeigt über offenes Feld, Objekt-Vertrautmachung und neuartige Objekt-Exploration. Maßstab = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Hier stellen wir ein Verfahren zur Durchführung einer großformatigen Ca 2+ -Bildgebung mit zellulärer Auflösung über mehrere kortikale Schichten in frei beweglichen Mäusen vor. Hunderte von aktiven Zellen können gleichzeitig mit einem Miniatur-, Kopf-Mikroskop gekoppelt mit einer implantierten Prismensonde beobachtet werden.

Mehrschicht-Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging in frei beweglichen Mäusen mit Prisma-Sonden und miniaturisierte Fluoreszenzmikroskopie

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

multi-layer-cortical-ca2-imaging-freely-moving-mice-with-prism-probes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

30.9K Aufrufe.  Inscopix Inc..  Hier stellen wir ein Verfahren zur Durchführung einer großformatigen Ca 2+ -Bildgebung mit zellulärer Auflösung über mehrere kortikale Schichten in frei beweglichen Mäusen vor. Hunderte von aktiven Zellen können gleichzeitig mit einem Miniatur-, Kopf-Mikroskop gekoppelt mit einer implantierten Prismensonde beobachtet werden. 

Serie: Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically identified cells during behavior1-6. Here we describe methods to perform two-photon imaging in mouse cortex while the animal navigates a virtual reality environment. We focus on the aspects of the experimental procedures that are key to imaging in a behaving animal in a brightly lit virtual environment. The key problems that arise in this experimental setup that we here address are: minimizing brain motion related artifacts, minimizing light leak from the virtual reality projection system, and minimizing laser induced tissue damage. We also provide sample software to control the virtual reality environment and to do pupil tracking. With these procedures and resources it should be possible to convert a conventional two-photon microscope for use in behaving mice.

Here we describe the experimental procedures involved in two-photon imaging of mouse cortex during behavior in a virtual reality environment.

Zwei-Photonen-Calcium Imaging in Mäuse Navigieren in einer Virtual-Reality-Umgebung

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Forschung

Verhalten

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a living animal&#8217;s brain. Moreover, the lengthy recovery from anesthesia limits the frequency of repeated recording/imaging episodes in longitudinal studies. Hence, new methods that would allow stable recordings from non-anesthetized behaving mice are expected to advance the fields of cellular and cognitive neurosciences. Existing solutions range from mere physical restraint to more sophisticated approaches, such as linear and spherical treadmills used in combination with computer-generated virtual reality. Here, a novel method is described where a head-fixed mouse can move around an air-lifted mobile homecage and explore its environment under stress-free conditions. This method allows researchers to perform behavioral tests (e.g., learning, habituation or novel object recognition) simultaneously with two-photon microscopic imaging and/or patch-clamp recordings, all combined in a single experiment. This video-article describes the use of the awake animal head fixation device (mobile homecage), demonstrates the procedures of animal habituation, and exemplifies a number of possible applications of the method.

This method creates a tangible, familiar environment for the mouse to navigate and explore during microscopic imaging or single-cell electrophysiological recordings, which require firm fixation of the animal&#8217;s head.

Flach platt Klima angehoben Plattform: Eine neue Methode zur Kombination von Verhalten mit Mikroskopie oder Elektrophysiologie auf Awake frei bewegen Nagetiere

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2 / 3 der Mäuse

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biologie

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

In-vivo-Imaging von Deep kortikalen Schichten mit einem MICROPRISMEN

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Neurowissenschaften

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

In Vivo Imaging von Cerebrospinalfluid Transport durch den intakten Mausschädel mittels Fluoreszenz-Makroskopie

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

Im lebenden Organismus Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung einer Maus mit einem großen Schädelfenster

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Zwei-Photonen- und Weitfeld-Kalziumbildgebung im Colliculus superior

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung der neuronalen Kodierung und der Mechanismen der visuellen Verarbeitung im Colliculus superior 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Mehrschicht-Cortical Ca

Zusammenfassung

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