Name: analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
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This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

1. Zellkultur von Human Brain mikrovaskulären Endothelzellen (HBMEC) <ol><li> Beschichtung von Zellkulturflaschen <ol><li> Um die Fibronektin-Lösung vorbereitet, mit 10 ml PBS in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. In 150 &amp; mgr; l Fibronektin und gut mischen. </li><li> Zur Abdeckung des Bodens einer T-25-Zellkulturflasche 2 mL der Fibronektin-Lösung. Inkubieren der Zellkultur-Kolben bei 37 ° C im Inkubator mindestens 3 h. Fibronectin beschichteten Kolben können für 2 Wochen bei 37 ° C / 5% CO 2 aufbewahrt werden. </li></ol></li><li> Säen und Zellkultur von HBMEC <ol><li> Aspirat Fibronektin-Lösung aus dem Boden der Zellkulturflasche. Hinzufügen 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² suspendiert in 6 ml ECM-B - Medium (= ECM-B mit 5% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% Endothelzellwachstum Ergänzung). Inkubieren bei 37 ° C / 5% CO 2. Überprüfen Sie das Zellwachstum täglich mit einem Mikroskop. </li><li> Ändern Sie das Medium alle 3 Tage.Ernte oder Teile von Zellen, wenn HBMEC etwa 80% Konfluenz erreichen. HBMEC sollte zwischen dem Kanal 1 und 15 verwendet werden, Verlust der physiologischen Eigenschaften zu vermeiden. </li></ol></li><li> Ernte HBMEC. <ol><li> Bereiten Accutase Lösung durch Mischen Accutase (1x) mit PBS in einem Verhältnis von 1: 1. Halten Accutase-Lösung bei 37 ° C in einem Wasserbad bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Übertragen ECM-B-Medium von der Zellkulturflasche in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Waschen HBMEC durch Zugabe von 5 ml PBS, um den Boden der Zellkulturflasche. Absaugen PBS und wiederholen Sie den Waschschritt noch zwei weitere Male. </li><li> In 2 ml vorgewärmten Accutase Lösung. für 2 min bei 37 ° C inkubieren. Danach HBMEC werden durch fest Antippen der Zellkulturflasche mehrmals wieder suspendiert. Zellablösung wird gesteuert unter Verwendung eines Mikroskops </li><li> Das ECM-B-Medium, die zuvor in einem Rohr 15 mL gespeichert wird zurück in die Zellkulturflasche hinzugefügt, sobald HBMEC abzulösen beginnen. Spülen Sie den Boden des Kolbens wiederholt, bis die meisten HBMEC sinderneut suspendiert. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 1 ml ECM-B-Medium. Zählen von Zellen und verdünne die Zellsuspension zu einer Endkonzentration von 3 × 10 5 pro mL HBMEC ECM-B - Medium zu erreichen. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung der Zellkultur-Einsätze <ol><li> Beschichtung von Zellkultureinsätzen Wichtiger Hinweis: Vermeiden Sie die Membran der Zellkultur - Einsätze zu berühren. <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l Fibronektin - Lösung (siehe Abschnitt 1.1.1) zu jedem Zellkultureinsatz (1A) und eine Vertiefung einer 96-Well - Flachbodenplatte (optischen Kontrolle gut). Inkubieren bei 37 ° C für mindestens 3 h. Nach der Inkubation absaugen Fibronektinlösung. </li><li> 100 l HBMEC Suspension auf die Zellkultur-Einsätze und die optische Kontrolle gut. Hinzufügen 600 ul ECM-B-Medium mit dem unteren Bereich der ZelleKultureinsätze. Inkubieren für 3 - 4 Tage bei 37 ° C / 5% CO 2 , bis Barrierenintegrität (1B) erreicht ist , das Zellwachstum kontrolliert durch mikroskopische Auswertung des HBMEC in der optischen Kontrollvertiefung. Hinweis: Das Zellwachstum über 4 Tage wird nicht empfohlen. </li><li> Optional: entzündliche Bedingungen nachahmen aspirieren das Medium aus dem unteren Fach und ersetzen sie durch ECM-B-Medium, ergänzt mit 500 U / ml IFN-γ / TNF-α 24 h vor der Migrationstest. </li></ol></li></ol> 3. Qualitätskontrolle mit Evans Blue am Tag des Auswanderungs Assay <ol><li> Herstellung von evans blaue Lösung <ol><li> PBS / B27-Lösung der Mischung 10 ml PBS mit 200 &amp; mgr; l B27 Ergänzung unter Verwendung einer 15 ml-Zentrifugenröhrchen herzustellen. Verdünnte Evans-Blau-Stammlösung (20 mg / ml PBS) 1: 1000 mit PBS / B27. </li></ol></li><li> Evans-Blau-Assay Permeabilität <ol><li> Anzusaugen, das Medium aus dem unteren Abteil durch die obere Kammer gefolgtvon einer Zellkultureinsatzes eine konfluente Monoschicht HBMEC enthält. 100 l evans blaue Lösung des Zellkultureinsatzes. </li><li> Hinzufügen 600 &amp; mgr; l PBS / B27 zu dem unteren Abteil und Inkubation für 60 min bei 37 ° C / 5% CO 2. Entfernen Sie vorsichtig den Zellkultureinsatz Pinzette. </li></ol></li><li> Evans-Blau-Messung <ol><li> Entfernen PBS / B27 aus dem unteren Abteil und übertragen wurden jeweils 100 ul zu zwei Vertiefungen einer schwarzen 96-Napf-Polystyrol-Platte mit flachem Boden. Legen Sie Platte in einem Tecan Infinite M200 Pro-Plattenleser und bestimmen die optimale z-Position. </li><li> Measure Anregung von Evans-Blau unter Verwendung von entsprechenden Einstellungen (zum Beispiel: Anregung: 620 nm, Emission: 680 nm, Anregungsbandbreite: 9 nm, Emissionsbandbreite: 20 nm, 175x Verbesserung, 25 blinkt, Integrationszeit: 20 us). </li><li> HBMEC Barrierefunktionen vergleichen erfassten Daten zu einer Standardkurve zeigt evans blau Permeation durch HBMEC zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Samen zu bestimmening Zellen (1B, rechts). </li></ol></li></ol> 4. Migration Assay <ol><li> Präparation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC). <ol><li> Fügen Sie 10 ml RPMI in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen eingewogen und 200 &amp; mgr; L B27 Ergänzung. Graf PBMC und zentrifugieren Zellen bei 300 · g für 5 min. Resuspendieren PBMC in einer Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml RPMI / B27. </li></ol></li><li> Aufbau des Migrationstest <ol><li> Aspirat Medium aus der unteren Kammer , gefolgt von der oberen Kammer aus dem Zellkultur - Inserts enthalten konfluenten Monolayern HBMEC (1A). Spender pro 100 uL PBMC - Suspension jeweils mit den Zellkultureinsätzen hinzufügen und auch eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen pro (in vitro - Kontrolle). </li><li> Hinzufügen 600 &amp; mgr; l RPMI / B27 zum unteren Kompartiment der Zellkultureinsätze und 500 &amp; mgr; l auf die PBMC der in vitro - Steuerung und inkubieren 6 h bei 37 ° C / 5% CO 2. </li&gt; </ol></li><li> Ernten von migrierten PBMC <ol><li> Nehmen Sie den Zellkultureinsatz aus einer Pinzette vorsichtig den Boden mit 400 ul PBS spülen, ohne die Membranen zu berühren. Entsorgen Sie den Zellkultureinsatz. </li><li> Fügen Sie 20 &amp; mgr; l Fließzahl Fluorospheres (etwa 1.000 Perlen / ul) zu dem unteren Abteil des Zellkultureinsatzes sowie an die in - vitro - Kontrolle und gut mischen. 1 ml der resultierenden Suspension PBMC Cytometry Rohre zu fließen. </li></ol></li></ol> 5. Durchflusszytometrie <ol><li> Probenvorbereitung <ol><li> Zentrifuge PBMC bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Antikörperlösung durch Zugabe von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern zu 100 &amp; mgr; l Durchflusszytometrie-Puffer (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) pro Probe. Für die Ergebnisse präsentiert unter 1 &amp; mgr; l CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 &amp; mgr; l CD56-PC7, 1 &amp; mgr; l CD8-A700 und 1 ul CD16-A750 wurden pro Probe verwendet. </li><li> Resuspendieren PBMC in 100 &amp; mgr; l der Antikörperlösung und bei 4 ° C für 30 min inkubieren. </li><li> Nach Eintragen von 250 &amp; mgr; L Durchflusszytometrie-Puffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 min. </li></ol></li><li> Probennahme <ol><li> Resuspendieren PBMC in der erforderlichen Menge (variiert in Abhängigkeit von dem Durchflusszytometer verwendet wird) der Durchflusszytometrie-Puffer. </li><li> Acquire stained PBMC unter Verwendung eines Durchflusszytometers mit einem aktiven Detektors zwischen 525 und 700 nm Wellenlängen-Durchflusszahl Fluorospheres (Anregung 488 nm, Emission 525 bis 700 nm) zu erfassen. (Die folgenden Schritte sind ein Beispiel, wenn ein Gallios Durchflusszytometer betrieben mit Kaluza G-Software verwendet wird. (1) Starten der Computer (2) Wenn das Betriebssystem vollständig geladen ist, startet das Durchflusszytometer durch den „Zytometer auf“ Drücken der Taste das jeweilige Erfassungsprotokoll Laden von „open-Protokoll“ drücken. (4) wählen Sie das gewünschte Protokoll und wählen Sie „öffnen“. (5) Duplizieren Sie das Protokoll für jede Probe mit der rechten Taste anklicken. (3)Maustaste auf das Protokoll sichtbar im virtuellen Karussell und einem Linksklick auf das Feld „Duplikat“. (6) Beschriften jede Probe in der Probenliste. (7) übertragen, die Proben zu den angegebenen Positionen des Karussells und die Übernahme beginnen.) </li></ol></li><li> Probenanalyse <ol><li> Öffnen resultierende Durchflusszytometriedaten die jeweilige Software. Bestimmt Anzahl von Subpopulationen von Interesse für transmigrierten PBMC sowie Zellen , die von in vitro - Kontrollvertiefungen und Zählung Fluorospheres fließt die jeweilige Analyse - Software. (Ein Beispiel für die Gating - Strategie wird im Ergebnisteil (Abbildung 1 C gegeben: die Transmigration von NK-Zell - Untergruppen zu analysieren, zunächst auswählen Lymphozyten in einer Seitwärtsstreuungskanals (SSC) gegen Vorwärtsstreuung Kanal (FSC) Plot Lymphocyten ist. dann in einem CD3 gegen CD56 Plot angezeigt und CD56 + CD3 -. NK - Zellen ausgewählt werden , zu unterscheiden zwischen NK-Zell - Untergruppen, NK - Zellen angezeigt inein CD56 gegen CD16 Grundstück und CD56 hell CD16 dim / - sowie CD56 dim CD16 + NK - Zellen ausgewählt. Außerdem Zählung Strömungs Fluorospheres werden aus einem FSC gegen SSC Stück ausgewählt und anschließend in einem Grundstück eines Kanals mit einer Emission zwischen 525 und 700 nm gegenüber der Zeit angezeigt, deren Anzahl zu bestimmen.) </li><li> Um die Gesamtzellzahl jeder Probe zu berechnen, normalisieren die erfasste Anzahl von Zellen unter Verwendung von Flusszahl Fluorospheres: <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Bestimmen Prozentsatz der migrierten Zellen als Verhältnis zwischen dem gesamten migrierten Zellen und den Gesamtzellen in der in - vitro - Kontrolle. </li></ol></li></ol>

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

Hier präsentieren wir eine Technik, um die Seelenwanderung von Lymphozyten über die menschliche Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen. In - vitro - Analyse von Lymphozyten - Migration auf das ZNS ist wichtig , grundlegende Prozesse der Lymphozyten - Extravasation, potentielle krankheitsbedingte Veränderungen und neue therapeutische Ansätze zu studieren. Mehrere Modifikationen der Blut-Hirn-Schranke Modell möglich. So könnten beispielsweise Zellen aus dem oberen Kompartime...

Lymphozytenmigration aus dem Blut in das Gewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Immunüberwachung. Eine Folge von spezifischen molekularen Wechselwirkungen stellt sicher , ortsspezifische Extravasation in Dünndarm, Haut, Lymphknoten, das zentrale Nervensystem (ZNS) und andere Gewebe 1. Veränderungen in der Lymphozytenmigration sind in der Pathophysiologie einer Reihe von weit verbreiteten Krankheiten 2 beteiligt. Migration in die Immunprivilegierten CNS ist streng reguliert und entsprechend Veränderungen dieses Verfahrens sind in CNS-bedingten Krankheiten wie Enzephalomyelitis 3, Neuromyelitis optica, Schlaganfall und Multiple Sklerose (MS) , 2, 4, 5, 6, 7 beteiligt. Daher ist es wichtig, Lymphozyten-Extravasation besser zu verstehen Krankheit Pathophysiologie und Entwicklung von Instrumenten für ein Studium<html> Melioration von Krankheitsbelastung 8, 9, 10, 11, 12. Lymphozyten wandern in das ZNS über verschiedene Routen. Extravasation durch postkapillaren Venolen in den Subarachnoidalraum über die Blut-Liquor - Schranke innerhalb des Plexus choroideus und über die Blut-Hirn - Schranke hat 1 beschrieben worden ist , 13, 14, 15. Migration durch die Blut-Hirn - Schranke wird durch die Wechselwirkung von Lymphozyten mit Endothelzellen 14 durchgeführt. Im Gegensatz Zellen in der Peripherie, Endothelzellen des ZNS äußern an endotheliale hohe Mengen an tight junction-Moleküle, um dadurch genau die Menge von Zellen und Proteinen Begrenzen der Lage Überquerung der Blut-Hirn-Schrankelass = &quot;xref&quot;&gt; 16. Entzündung führt Lockerung der tight junctions und induziert die Expression von Adhäsionsmolekülen; Somit verbessert Lymphozytenmigration in das ZNS 1, 17, 18. Extravasation über die Blut-Hirn-Schranke ist ein mehrstufiger Prozess. Haltegurt - Lymphocyten an die Endothelzellen und dann entlang dem Endothel in einem Fertigungsrolle hauptsächlich durch Selectine 1, 15 vermittelt. Anschließend Wechselwirkungen zwischen durch das Endothel sekretiert Chemokine und Chemokin den jeweiligen auf Lymphozyten induzieren Konformationsänderungen exprimierten Rezeptoren der Integrine, wodurch feste Adhäsion an die Endothelzellen 1 zu fördern. Schließlich, Lymphozyten entweder Durchforstungs entlang der endothelialen Barriere gegen den Blutstrom, bevor sie in den perivaskulären Raum transmigrating oder abgewürgt sofort und direkt transmigrate an der Stelle der festen Haftung 1, 19, 20. All diese Schritte der Lymphozyten Extravasation kann in vitro unter Verwendung von unterschiedlichen Techniken 21 analysiert werden. Zeitraffer-Videomikroskopie verwendet , um das anfängliche Tethering zu studieren und Walzen 15. Adhäsions - Assays bieten detaillierte Informationen über feste Verhaftung Barrieren endothelialer 22. Transmigrationsassays als 21 hier erlauben Analyse von Immunzellen - Transmigrations demonstriert, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. Unter Verwendung der humanen in vitro - Modell Blut - Hirn - Schranke, konnten wir kürzlich zeigen , dass eine höhere migrAtory Kapazität von CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen im Vergleich zu ihrem CD56 dim CD16 + Pendants durch ein Vorherrschen dieser NK - Zell - Untergruppe in der intrathekalen Kammer 21 reflektiert wurde. So ist unser Versuchsaufbau scheint geeignet zu sein , die in vivo - Situation zu imitieren.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>without CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; or MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Fibronectin 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>from bovine plasma</td></tr><tr><td>T-25 cell culture flask</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell growth supplement</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>clear, 6.5 mm diameter, 3.0 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>96-well flat bottom plate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>stock solution: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x concentrated</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well black flat bottom plate</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Flow Count Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 10-color flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>clone N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>clone 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>clone RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>clone B9.11</td></tr></tbody></table>

analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier

Lymphocyte Extravasation in das zentrale Nervensystem (ZNS) ist entscheidend für die Immunüberwachung. Krankheitsbedingte Veränderungen der Lymphozyten-Extravasation könnten in pathophysiologischen Veränderungen im ZNS führen. So Untersuchung der Lymphozytenmigration in das ZNS ist wichtig, entzündlichen ZNS-Erkrankungen zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Hier präsentieren wir ein in vitro - Modell der menschlichen Blut-Hirn - Schranke Lymphozyten - Extravasation zu studieren. Human brain mikrovaskuläre Endothelzellen (HBMEC) sind konfluent auf einem porösen Polyethylenterephthalat gewachsenen Transwell einzufügen das Endothel der Blut-Hirn-Schranke zu imitieren. Barrierefunktion durch Zonula occludens Immunhistochemie, transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) Messungen sowie Analyse von Evans-Blau-Permeation validiert. Dieses Modell ermöglicht Untersuchung der Diapedese von seltenen Lymphozytteilmengen wie CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen. FurthermErz, die Auswirkungen von anderen Zellen, Zytokinen und Chemokinen, krankheitsbedingte Veränderungen und unterschiedliche Behandlungsschemata auf die Migrationsfähigkeit von Lymphozyten untersucht werden. Schließlich kann die Wirkung von Entzündungsreizen sowie unterschiedliche Behandlungsschemata auf der endothelialen Barriere analysiert werden.

Repräsentative Ergebnisse zeigen Transmigration von NK-Zell- und T-Zell - Untergruppen mit dem menschlichen Blut-Hirn - Schranke - Modell (1A) gezeigt. Die Integrität der HBMEC Monoschicht wurde durch Anfärben des tight junction Moleküls ZO-1, transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) Messungen validiert, und Evans - Blau - Permeation (1B). Folgende 3 - 4 Tage Kultur ausgedrückt HBMEC das tight junction Molekül ZO-1 (1B, lin...

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Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

20.3K Aufrufe.  University Hospital Münster. Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro. 

Serie: Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Forschung

Biotechnik

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Medizin

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Immunologie und Infektion

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

Luzifergelb - Ein robuster parazellulärer Permeabilitätsmarker in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Barriere

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Analyse von Blut-Hirn-Schrankenmodellen mittels Immunfluoreszenzfärbung

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung des Einsatzes von Tissue-Chip-Technologie für die Untersuchung von menschlichem Gewebe 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszenzfarbstoffbasierte Visualisierung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke bei Mäusen

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung

Zusammenfassung

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Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

Einrichten einer

Ein

Luzifergelb - Ein robuster parazellulärer Permeabilitätsmarker in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Barriere

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma