Name: analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

1. Hücre İnsan Beyin mikrovasküler endotel hücreleri Kültürü (HBMEC) <ol><li> hücre kültürü şişelerinde kaplanması <ol><li> Fibronektin, bir çözelti hazırlamak bir 15 mL santrifüj tüpüne 10 ml PBS ekleyin. 150 ul fibronektin ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> alt kapak için bir T-25 hücre kültür şişesi fibronektin çözeltisi 2 ml. kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de en az 3 saat boyunca hücre kültür şişesi inkübe edin. Fibronektin kaplanmış şişeler 37 ° C /% 5 CO2 ile 2 hafta boyunca depolanabilir. </li></ol></li><li> Tohumlama ve HBMEC hücre kültürü <ol><li> Hücre kültür şişesi altından aspire fibronektin çözeltisi. 6 ml ECM-b ortamda süspansiyon haline getirilmiş 7.2 x 10 4 HBMEC / cm² ekle (= ECM-b,% 5 fetal sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 endotel hücre büyüme takviyesi ile takviye edilmiştir). 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edin. Bir mikroskop kullanılarak günlük hücre büyümesini kontrol edin. </li><li> 3 günde ortamı değiştirin.Hasat veya HBMEC yaklaşık% 80 konfluansa ulaşmalarına bölünmüş hücreleri. HBMEC fizyolojik özellikleri kaybını önlemek için geçit 1 ile 15 arasında kullanılmalıdır. </li></ol></li><li> Hasat HBMEC. <ol><li> 1 oranında PBS ile Accutase (1x) ile muamele Accutase çözelti hazırlayın: 1 arasındadır. sonraki kullanıma kadar bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de Accutase çözüm tutun. </li><li> 15 ml santrifüj tüpüne hücre kültür şişesi ECM-b ortamı aktarın. Hücre kültür şişesinin dibinde 5 ml PBS ilave edilerek HBMEC yıkayın. PBS aspire ve yıkama adım iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 2 mL Accutase önceden ısıtılmış solüsyonu ekleyin. 2 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Sonrasında HBMEC sıkıca hücre kültürü şişesi birkaç kez dokunarak yeniden askıya alınır. Hücre kopması, bir mikroskop kullanılarak kontrol edilir </li><li> Daha önce, bir 15 ml tüp içinde saklanan ECM-b-orta kısa HBMEC ayırmak için başlangıç ​​olarak geri hücre kültür şişesi içine ilave edilir. En HBMEC kadar tekrar tekrar şişenin alt durulayınyeniden süspansiyon haline getirilmiştir. </li><li> 15 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve 1 mL ECM-b ortamda hücrelerin yeniden askıya. Hücre sayımı ve ml ECM-b ortamı başına 3 x 10 5 HBMEC bir son konsantrasyon elde etmek için bir hücre süspansiyonu seyreltin. </li></ol></li></ol> Hücre Kültürü ekler 2. hazırlanması <ol><li> hücre kültürü ekler kaplanması Önemli not: hücre kültürü ekler zarını dokunmaktan kaçının. <ol><li> Her bir hücre kültürü eki 100 uL fibronektin çözeltisi (1.1.1 bakınız) (Şekil 1A) ve bir 96-gözlü düz tabanlı plakanın bir kuyu (optik kontrol çukur) ekleyin. 37 ° C&#39;de en az 3 saat süreyle inkübe edin. İnkübasyon aspirat fibronektin çözeltisi sonra. </li><li> 100 uL HBMEC hücre kültürü ekler süspansiyonun ve iyi optik kontrol ekleyin. Hücrenin alt bölmeye 600 ul ECM-b orta ekleyinkültür ekleri. , 37 ° C / 5 bariyer bütünlüğünü (Şekil 1B) kadar% CO2 ulaşıldığında 4 gün de optik kontrol HBMEC mikroskopik değerlendirme hücre büyümesini kontrol - 3 inkübe edin. Not: Dört gün ötesinde Hücre büyümesi önerilmez. </li><li> İsteğe bağlı: enflamatuvar koşulları taklit etmek için alt bölmeden orta aspire ve 24 saat göç deneyi öncesinde 500 U / ml IFN-γ / TNF-a ile takviye ECM-b ortamı ile değiştirin. </li></ol></li></ol> Hicret Testinin gününde Evans Blue ile 3. Kalite Kontrolü <ol><li> Evans mavisi çözeltisinin hazırlanması <ol><li> 15 ml santrifüj tüpü kullanılarak 200 ul B27 eki ile, PBS / B27 çözeltisi karışımı 10 ml PBS hazırlamak. Evans mavi stok çözeltisi ile seyreltilir (20 mg / ml PBS) 1: PBS / B27 1.000. </li></ol></li><li> Evans mavisi geçirgenlik deneyi <ol><li> Üst bölme, ardından alt bölmeden orta aspirekonfluent tek tabaka HBMEC ihtiva eden bir hücre kültürü ucun. hücre kültürü eki 100 mcL Evans mavisi solüsyonu ekleyin. </li><li> Alt bölmeye 600 uL PBS / B27 ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO2 &#39;de 60 dakika boyunca inkübe edin. Dikkatle forseps kullanarak hücre kültürü eki çıkarın. </li></ol></li><li> Evans mavisi ölçüm <ol><li> alt bölme PBS / B27 çıkarın ve siyah bir polistirol 96-gözlü düz dipli levhanın iki oyuklarına 100 uL her aktarın. bir Tecan Sonsuz M200 Pro plaka okuyucuda plaka yerleştirin ve optimal z konumunu belirler. </li><li> (Örneğin: eksitasyon: 620 nm, emisyon: 680 nm, bant genişliği eksitasyon: 9 nm, emisyon bant genişliği: 20 nm, 175x geliştirme, 25 yanıp söner, entegrasyon süresi: 20 us) Evans mavisi kullanılarak ilgili ayarlar Ölçü uyarım. </li><li> HBMEC bariyer fonksiyonu tohum sonra farklı zaman noktalarında HBMEC boyunca Evans mavi geçirgenliğini tasvir eden bir standart eğriye elde edilen veriler karşılaştırma belirlemek içining hücreler (sağ Şekil 1B). </li></ol></li></ol> 4. Yer değiştirme tahlili <ol><li> periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinin (PBMC) hazırlanması. <ol><li> 15 ml lik santrifüj tüpüne 10 ml RPMI ekleyin ve 200 uL B27 ek ekleyin. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de PBMC ve santrifüj hücreleri sayın. 5 x 10 6 hücre / ml RPMI / B27 bir nihai konsantrasyona kadar PBMC yeniden askıya. </li></ol></li><li> göç deneyi kunnak <ol><li> Konfluent HBMEC mono tabakalar (Şekil 1A) ihtiva eden hücre kültürü eklerin üst bölme ve ardından alt bölmeden orta aspire. Donör başına başına 24 oyuklu plakanın bir oyuk (in vitro kontrol), hücre kültürü ekler 100 uL PBMC süspansiyonu, her ekleme ve. </li><li> In vitro kontrol ait PBMC hücre kültürü ekler ve 500 uL alt bölmeye 600 uL RPMI / B27 ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO2 de 6 saat inkübe edilir. </li&gt; </ol></li><li> Taşınan PBMC&#39;nin Hasat <ol><li> forseps kullanılarak hücre kültürü eki çıkarın ve dikkatli bir şekilde membran dokunmadan 400 uL PBS ile alt yıkayın. Hücre kültürü eki atın. </li><li> 20 uL akış sayısı flüoro ekleme hücre kültürünün alt bölüme (yaklaşık 1.000 boncuk / uL) in vitro kontrol için hem de eklemek ve iyice karıştırın. borular akış sitometrisi PBMC süspansiyonun devri 1 ml. </li></ol></li></ol> 5. Akış Sitometri <ol><li> örnek hazırlama <ol><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin PBMC. </li><li> 100 ul florokrom-eşlenik antikorlar ekleyerek antikor çözeltisi hazırlayın numune başına (PBS /% 1 BSA / 2 mM EDTA) içinde tampon akış sitometrisi. 1 uL CD4-FITC aşağıdaki sonuçları elde etmek için, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5 @, 1 uL, CD56-PY7, 1 uL CD8-A700 ve 1 uL CD16-A750 numune başına kullanılmıştır. </li><li> PB Re-askıyaAntikor çözeltisinin 100 uL MC ve 4 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li><li> 250 uL, 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de tampon ve santrifüj akış sitometrisi ekleyin. </li></ol></li><li> Numune toplama <ol><li> gereken miktarda PBMC askıya yeniden akış sitometrisi tampon maddesiyle (kullanılan akış sitometresi bağlı olarak değişir). </li><li> akış sayısı flüoro tespit etmek için 525 ile 700 nm dalga boyunda arasında aktif detektörü ile akış sitometresiyle lekeli PBMC Edinme (eksitasyon 488 nm, emisyon 525-700 nm). (Aşağıdaki adımlar Kaluza G yazılımı ile çalışan sitometresi Gallios akış kullanıldığında bir örnektir. (1) başlatın işletim sistem tamamen dolu olduğu zaman (2), renkli &quot;sitometresinde&quot; tuşuna basarak akış sitometresi başlangıç . (3) &quot;açık protokol&quot; düğmesine basarak ilgili edinim protokolünü yükleyin. (4) gerekli protokolü seçin ve &quot;açık&quot; seçeneğini seçin. (5) sağ ile tıklayarak her numune için protokol çoğaltınSanal atlıkarınca ve &quot;yinelenen&quot; sahada sol klik görünür protokolüne fare düğmesi. (6) örnek bir liste her bir örnek olarak etiketleyin. (7) döner piramit belirtilen pozisyonlarında örnekleri aktarın ve satın alma başlar.) </li></ol></li><li> Numune analizi <ol><li> İlgili yazılım kullanarak veri sitometrisi Açık çıkan akışı. In vitro kontrol gözlerinden elde transmigrant PBMC ilgi olarak hücre alt popülasyonlarının sayısını belirler ve ilgili analiz yazılımı kullanılarak sayım flüoro akar. (Yolluk stratejinin bir örneği (Şekil sonuç bölümünde 1 C verilmiştir: İleri saçılma kanalı (FSC) grafiği yana doğru bir dağılım kanalı (SSC) içerisinde lenfositleri seçmek için, ilk, NK-hücre alt setlerinin bir transmigrasyonu, analiz etmek lenfositlerdir. daha sonra bir CD56 grafiği CD3 ve CD56 +, CD3 görüntülenen -. NK hücreleri seçilmektedir NK-hücre alt kümeleri arasında ayrım yapmak için, NK hücreleri de gösterildiBir CD56 CD16 karşı grafiğidir ve CD56 parlak CD16 / dim - hem de CD56 loş CD16 + NK hücreleri seçilmektedir. Buna ek olarak, akış sayısı florosferler bunların sayısını belirlemek için zamana karşı 525 ila 700 nm arasında bir emisyon ile bir kanalın bir arsa görüntülenen daha sonra FSC SSC karşı grafiğinden seçilir ve.) </li><li> Her numunenin toplam hücre sayısını hesaplamak için, akış sayısı flüoro kullanarak hücrelerin tespit sayısını normalize: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Toplam geçen hücre ve in vitro kontrol toplam hücrelerin arasındaki oran olarak yayılan hücrelerin yüzdesini belirlemek. </li></ol></li></ol>

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

Burada insan kan-beyin bariyeri üzerinden lenfositlerin tenasüh araştırmak için bir teknik sunar. CNS&#39;ye lenfosit göçü in vitro analizleri, lenfosit ekstravazasyonu, potansiyel hastalıkla ilgili değişiklikler ve yeni terapötik yaklaşımlar temel işlemlerini incelemek için önemlidir. Kan-beyin bariyeri modelinin çeşitli modifikasyonlar mümkündür. Örneğin, üst bölmeden hücreleri göç-hücre populasyonunun bileşimini incelemek için analiz edilebilir. Bu...

dokulara kan lenfosit göçü immün gözetim için çok önemlidir. Özel molekül etkileşimleri sonunda bir dizi ince bağırsak, deri, lenf düğümleri, merkezi sinir sistemi (CNS) ve diğer dokular 1 içine alana özgü ekstravazasyonu sağlamaktadır. Lenfosit göçü değişiklikler yaygın hastalıklar 2 bir dizi patofizyolojisinde rol oynamaktadır. Immün öncelikli CNS&#39;ye Geçiş sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ve buna göre bu işlemin değişiklikler ensefalomiyelit 3, neuromyelitis optica, inme ve multipl skleroz (MS) 2, 4, 5, 6, 7 gibi merkezi sinir sistemi ile ilgili hastalıklar dahil olmaktadır. Nedenle, daha iyi hastalık patofizyolojisinin ve araçları geliştirmeye lenfosit ekstravazasyondan incelemek için önemlidir<html> hastalık yükü 8, 9, 10, 11, 12 ıslah. Lenfositler farklı yollardan CNS içine göç ederler. Kan-beyin bariyeri koroid pleksus içinde ve boyunca, kan-beyin-omurilik sıvısı bariyer subaraknoid boşluk içine postkapiler venüllerde yoluyla damar dışına 1, 13, 14, 15 tarif edilmiştir. Kan-beyin bariyeri boyunca geçiş endotel hücreleri 14 lenfositlerin etkileşimi ile yürütülür. periferde endotelyal hücrelere aksine, merkezi sinir sisteminin endotel hücreleri, böylece sıkı bir kan-beyin bariyerini geçme kabiliyetine sahip olan hücreleri ve protein miktarının sınırlandırılması, sıkı bağlantı moleküllerinin yüksek miktarda ekspreselass = &quot;xref&quot;&gt; 16. sıkı bağlantıları gevşemesine iltihabı sonuçları ve yapışma moleküllerinin ifadesini indükler; Bu şekilde, merkezi sinir sistemi 1, 17, 18 içine lenfosit göçünü artar. Kan-beyin bariyeri üzerinden damar dışına çok aşamalı bir süreçtir. Endotel hücreleri için ipi lenfositler ve daha sonra esas olarak selektinler 1, 15 kaynaklı bir işlemde endotel boyunca rulo. Daha sonra, lenfositler üzerinde ifade edilen endotel tarafından salgılanan kemokinlerin ve ilgili kemokin reseptörlerinin arasındaki etkileşimler endotel hücreleri 1 yapışmasını teşvik integrinlerin uyumsal değişiklikleri başlatır. Son olarak, perivasküler boşluğa transmigrating önce kan akışına karşı endotelyal engeli boyunca her iki taramayı lenfositler ya da hemen ve doğrudan doğruya şanzıman durakfirması yapışma 1, 19, 20 bölgesinde igrate. Lenfosit ekstravazasyon Tüm bu olaylar farklı teknikler 21 kullanılarak in vitro analiz edilebilir. Zaman atlamalı video mikroskopi başlangıç tethering&#39;i ve 15 haddeleme incelemek için kullanılır. Adezyon tahliller engelleri 22 endotel firma tutuklama ile ilgili ayrıntılı bilgi sağlar. Burada gösterildiği gibi transmigrasyon tahlilleri, bağışıklık-hücre göçüne 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 analizini sağlar. In vitro kan beyin bariyeri modelinde insan kullanarak, daha yüksek bir MIGR olduğunu göstermektedir geçenlerde olabilirCD56 parlak CD16 arasında atory kapasitesi / dim - NK hücrelerini CD16 + muadilleri intratekal bölme 21 bu NK hücresi alt-kümesinin bir ağırlığı tarafından yansıyan dim bunların CD56 ile karşılaştırıldığında. Böylece, bizim deney düzeneği in vitro durumu taklit etmek uygun görünmektedir.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>without CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; or MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Fibronectin 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>from bovine plasma</td></tr><tr><td>T-25 cell culture flask</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell growth supplement</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>clear, 6.5 mm diameter, 3.0 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>96-well flat bottom plate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>stock solution: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x concentrated</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well black flat bottom plate</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Flow Count Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 10-color flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>clone N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>clone 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>clone RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>clone B9.11</td></tr></tbody></table>

analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier

Merkezi sinir sisteminde (CNS) içine Lenfosit ekstravazasyon immün gözetim için kritiktir. lenfosit ekstravazasyon hastalığa ilgili değişiklikler CNS&#39;de patofizyolojik değişikliklere neden olabilir. Böylece, CNS içine lenfosit göç soruşturma inflamatuar CNS hastalıkları anlamak ve yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek önemlidir. Burada lenfosit ekstravazasyonu çalışma insan kan-beyin engelinin bir in vitro model sunmaktadır. İnsan beyni mikrovasküler endotelyal hücreleri (HBMEC) confluently, kan-beyin bariyerinin endotelyumu taklit etmek için eklemek Transwell gözenekli polietilen tereftalat yetiştirilmektedir. Bariyer fonksiyonu zonula occludens immünohistokimya, transendotelyal elektrik direnci (TEER) ölçümleri olarak Evans mavisi nüfuz analizi ile doğrulanır. NK hücrelerini - Bu model, / dim CD56 parlak CD16 gibi nadir lenfosit alt grupları diyapedezin soruşturma sağlar. Furthermcevher, diğer hücrelerin, sitokinler ve kemokinlerin, hastalıkla ilişkili değişiklikler ve lenfosit göç kapasitesine belirgin bir tedavi yönteminin etkinliği incelenebilir. Son olarak, endotel bariyere üzerinde iltihabı etkiler etkisi yanı sıra, farklı tedavi rejimleri analiz edilebilir.

NK-hücresi ve insan kan-beyin bariyeri modeli (Şekil 1A) kullanılarak T-hücresi alt kümelerinin bir transmigrasyonu, Örnek teşkil eden sonuçlar gösterilmektedir. HBMEC tek tabaka bütünlüğü sıkı bir bağlantı molekülü ZO-1, transendotelyal elektrik direnci (TEER) ölçülmesi, ve Evans mavisi geçirgenlik (Şekil 1B) lekelenmesi ile doğrulandı. 3 sonra - 4 gün kültür HBMEC sıkı bir bağlantı molekülü ZO-1 (sol Şekil 1...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

20.3K Görüntüleme.  University Hospital Münster. Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro. 

Video: Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Biyomühendislik

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Tıp

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

Lucifer Sarı - İnsan Kan-beyin Bariyerbir Hücre Modeli sağlam bir Parasellüler Geçirgenlik Marker

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

İmmünofloresan Boyama ile Kan-Beyin Bariyer Modellerinin Analizi

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

Yazar Spotlight: İnsan Dokularını İncelemek için Doku Çipi Teknolojisinin Kullanımını Geliştirme 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Farelerde Kan-Beyin Bariyeri Parçalanmasının Floresan Boya Bazlı Görselleştirilmesi

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fare Modelinde Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Değerlendirilmesi

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fare Modelinde Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Değerlendirilmesi

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

Ayarlama-up bir

bir

Lucifer Sarı - İnsan Kan-beyin Bariyerbir Hücre Modeli sağlam bir Parasellüler Geçirgenlik Marker

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fare Modelinde Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Değerlendirilmesi

Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fare Modelinde Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Değerlendirilmesi