Wir sind dankbar, dass Annika Engbers und Frank Kurth für ihre hervorragende technische Unterstützung und Dr. Markus Schäfer (nanoanalytics GmbH) für hilfreiche Diskussionen über TEER-Messungen. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt wird, SFB1009 Projekt A03 bis HW und LK, CRC TR128, Projekte A08; Z1 und B01 bis LK und HW, und das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (Medizinische Fakultät Münster) Gewährungsnummer Kl2 / 2015/14 bis LK.

Für alle Versuche wurden die Mäuse gezüchtet und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in der zentralen Tieranlage an der Universität Münster, nach den deutschen Richtlinien für die Tierpflege gehalten. Alle Versuche wurden nach den Richtlinien des Tierversuchsethikkommission durchgeführt und von den örtlichen Behörden des Landes Nordrhein-Westfalen, Deutschland (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) zugelassen. 1. MBMEC Isolierung und Kultur HINWEIS: Isolieren MBMECs wie zuvor im Detail 14 mit den folgenden Modifizierungen beschrieben: <ol><li> Sacrifice 20 erwachsenen C57BL / 6 - Mäuse (6-8 Wochen alt) durch CO 2 Inhalation und bestätigen ihr Tod durch Herz- und Atemstillstand festzustellen. </li><li> Spülen Sie die Maus mit 70% Ethanol und enthaupten es Schere; Entfernen Sie die Kopfhaut einer Pinzette und Schere. Machen Einschnitte auf der linken und rechten Seite des Schädels, vom Foramen Magnum beginnen. Heben Sie den Schädel von seinem Schwanz Seite und takE das Gehirn mit einer Pinzette aus. </li><li> Unter einem Laminar-Flow-Haube, sterile Pinzette das Gehirn in einer Petrischale zu legen und den Hirnstamm, Kleinhirn und Thalamus, halten nur die Rinde entfernen. HINWEIS: Die Verwendung eines Mikroskops ist nicht erforderlich, für jeden dieser Schritte. </li><li> Legen Sie die Rinde auf ein Stück sterile Western-Blot-Papier und rollen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette bis Meningen sind nicht mehr sichtbar. </li><li> Nach der mechanischen und enzymatischen Verdau (nach dem Protokoll 14) sammeln Endothelzellen aus der Dichtegradient durch einen langen, sterile Nadel und einen 5 ml Kolben verwendet wird . Endothelial Zellen erscheinen als eine trübe Schicht über dem roten Ring mit Erythrozyten. Transfer 20-25 ml dieser Schicht in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen; ganz oben auf der Röhre mit DMEM auf. </li><li> Nach zwei Runden der Wasch 14, Resuspendieren der Zellen in 6 ml MBMEC Medium , das Puromycin (4 &amp; mgr; g / ml) und sie auf sechs beschichteten Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen Samen; lassen Sie sie in einem GewebeKulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 (bezeichnet als &quot;Inkubator&quot; von hier an) für drei Tage. HINWEIS: Details der MBMEC Beschichtungslösung, siehe Materialien Tabelle. </li><li> Ändern Sie das Medium durch Zugabe von 1 ml zu jeder Vertiefung von frischem MBMEC Medium ohne Puromycin; legte die Platte wieder bei 37 ° C und 5% CO 2 für zwei weitere Tage. </li></ol> 2. Ernte MBMECs <ol><li> Am Tag fünf nach MBMEC Isolation Lösung Precoat-durchlässige Einsätze mit MBMEC Beschichtung: 80 ul Lösung pro Einsatz hinzufügen und bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3 Stunden verlassen. </li><li> Pipette vorsichtig die Beschichtungslösung und die Einsätze der Luft trocknen für 30 Minuten lassen. 2 ml Raumtemperatur (RT) PBS in jede Vertiefung der Platte, MBMECs mit dem Medium zu waschen; Wiederholen Sie diesen Schritt. In 0,05% Trypsin-EDTA (300 &amp; mgr; l pro Vertiefung) und lassen Sie die Platte in den Inkubator für 5-10 min. </li><li> 2 ml MBMEC Medium zu jeder Vertiefung zu stoppenTrypsinierung. Übertragung der gesammelten Zellen auf eine 15 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere sie bei 700 × g für 8 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml MBMEC Medium ohne Puromycin. </li><li> Zählen Sie die Zellen; 10 ul der Zellsuspension mischen mit 90 &amp; mgr; l 0,04% Trypan-Blau (10x Verdünnung der Zellen). Je 10 ul dieser Mischung zwischen der Glasabdeckung und die Zellzählung Kammer (Hämozytometer). Zählen Trypan Blau-freien Zellen in allen vier Quadranten der Kammer (N) und bestimmen die durchschnittliche Anzahl der gezählten Zellen (N &#39;) wie folgt: N&#39; = N / 4 ist. </li><li> Berechnen der Zellkonzentration (in 10 &amp; sup6 ; Zellen / ml) mit der folgenden Formel: C = N &#39;x 10 4 x 10, wobei 10 4 durch die Abmessungen des Hämozytometer gegeben und 10 ist der Verdünnungsfaktor aus Schritt 2.4. </li><li> Seed 2 x 10 4 Zellen in einem Volumen von 260 &amp; mgr; l pro Platte. In 810 ul MBMEC mittleren bis unteren Fach jeder Vertiefung. Legen Sie die Platte mit Einsätzen in den Inkubator, bis sie bereit mit Abschnitt 4 fortzufahren. HINWEIS: Die Volumina für die obere und untere Fach sind einsatzspezifisch und funktionieren nicht für alle 24-Well-Formate. </li></ol> 3. CD4 + T - Zell - Isolierung und Stimulation <ol><li> CD4 + T - Zell - Isolation <ol><li> Sacrifice einer erwachsenen Maus (6-8 Wochen alt) durch CO 2 Inhalation und bestätigen seinen Tod durch Herz- und Atemstillstand festzustellen. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken auf einer sauberen Dissektion Bord und spülen Sie ihn mit 70% Ethanol; Verwenden einer sterilen Schere und Pinzette das Peritoneum zu öffnen und die Milz und Lymphknoten (Leisten, Achsel, brachial und Gebärmutterhalskrebs) zu entfernen; Schließlich übertragen die Gewebe in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, die 5 ml PBS auf Eis. </li><li> Unter laminaren Strömungshaube, übertragen das Gewebe durch PBS mit dem Gewebe in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 70 &amp; mgr; m Zellsieb auf Dekantierung; homogenisierendas Gewebe durch sie mit einer 1 ml Kolben durch das Sieb zu drücken. </li><li> 30 ml FACS-Puffer und Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 10 ml FACS-Puffer. Filtern Sie die Suspension durch eine 40 um Zelle Sieb, fügen Sie eine weitere 20 ml FACS-Puffer auf das Rohr. </li><li> Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 500 &amp; mgr; l FACS-Puffer. </li><li> In 20 ul Maus-CD4 magnetischen Mikrokügelchen, gut mischen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C. 25 ml FACS-Puffer und Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> In der Zwischenzeit legen Sie eine LS-Trennsäule in den Magneten und spülen Sie ihn mit 3 ml FACS-Puffer. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 3 ml FACS-Puffer. </li><li> Hinzufügen von Zellen an die Säule. Die Säule wird mit 3 ml FACS dreimal puffern. Entfernen Sie die Säule aus dem Magneten und legen Sie es auf eine neue 15 ml centrifugation Rohr. 5 ml FACS-Puffer, spülen Sie die markierten Zellen mit dem Säulenkolben und Zentrifuge bei 500 xg für 5 min 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 3 ml T-Zellmedium. Zählen Sie die Zellen wie in 2.4 und Samen 1 x 10 5 Zellen in 100 ul Medium pro Vertiefung. </li></ol></li><li> CD4 + T - Zell - Stimulation <ol><li> Polyklonale CD4 + T - Zell - Stimulation <ol><li> Pre-coat eine Rundboden 96-Napf-Platte mit gereinigtem anti-Maus-CD3-Antikörper (Klon 145-2C11) in PBS, bei einer gewünschten Endkonzentration. Zum Beispiel, vor der Beschichtung der volle Platte mit α-CD3 bei 1 &amp; mgr; g / ml, mischen 10 ul der Antikörper (Stammkonzentration = 0,5 mg / ml) mit 5 ml PBS, Wirbel und 50 ul der Mischung jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Lassen Sie die Platte in den Inkubator für 3 Stunden. Nachdem die T-Zellen zu isolieren, waschen Sie die vorgezogene Platte zweimal mit PBS. Hinzufügen gereinigter anti-CD28-Antikörper (Clon37,51) auf isolierte T - Zellen in einer Endkonzentration gewünschte (beispielsweise bei 1 &amp; mgr; g / ml); gut mischen. Samen der T-Zellen und lassen sie in den Inkubator für zwei bis drei Tage. </li></ol></li><li> Antigen-spezifische CD4 + T - Zell - Stimulation mit dendritischen Zellen (DCs) HINWEIS: Wenn DCs als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) verwendet werden, folgen Sie dem Protokoll für die T-Zell-Isolierung, mit folgenden Ausnahmen: <ol><li> Bevor die Milz Homogenisieren, injizieren sie mit 1 ml Kollagenase Typ IA in PBS bei 0,5 mg / ml und übertragen sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Inkubieren im Wasserbad bei 37 ° C für 15 min. Nach Waschen mit PBS, das Pellet in FACS-Puffer resuspendiert und 20 ul Maus CD11c magnetische Microbeads, anstelle von CD4 Microbeads hinzuzufügen. </li><li> Verwenden Sie eine MS Trennsäule und die entsprechenden Volumina: Spülen der Säule mit 1 ml FACS-Puffer; Die Zellen in 1 ml FACS-Puffer und wasche die Säule mit 1 ml FACS-Puffer dreimal. </li><li> Anzeiged Antigen der Wahl zu DCs (zB Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) aa 35-55 bei 20 ug / ml), gut mischen und Samen 5 x 10 4 Zellen in 100 &amp; mgr; l der T - Zellkulturmedium pro 96-Runden-Bottom Gut. </li><li> 1 x 10 5 T - Zellen in 100 &amp; mgr; l der T - Zellkulturmedium pro 96-Rundboden-gut am Ende, wie es in dem Protokoll für T - Zell - Isolierung beschrieben. </li></ol></li><li> Antigen-spezifische CD4 + T - Zell - Stimulation mit B - Zellen HINWEIS: Wenn B-Zellen als APCs verwendet werden, folgen Sie dem Protokoll für die T-Zell-Isolierung, mit folgenden Ausnahmen: <ol><li> Verwenden Milzen aus transgenen Mäusen , deren B - Zellen sind Antigen-spezifische ( zum Beispiel IgH MOG (Th) Mäuse, deren B - Zellen spezifisch erkennen MOG 35-55). </li><li> Verwenden antigen-spezifischen T - Zellen (zB von TCR MOG (2D2) -Mäuse). In 20 ul Maus CD19 magnetischen Mikrokügelchen anstelle von CD4-Mikrokügelchen. </li><li> Fügen Sie das Antigen der Wahl an die B cells (zB MOG 35-55 bei 20 ug / ml), gut mischen und Samen 5 x 10 4 Zellen in 100 &amp; mgr; l der B - Zellkulturmedium pro 96-Runden-bottom-gut. </li><li> 1 x 10 5 T - Zellen in 100 &amp; mgr; l der T - Zellkulturmedium pro 96-Runden-bottom-gut, wie es in dem Protokoll für T - Zell - Isolierung beschrieben. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Einrichten und Durchführen TEER Mess <ol><li> Legen Sie die 24-Well-Modul des TEER Instrument unter der Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie die Deckel und Platz Einsätze mit MBMECs im Gerät mit einer Pinzette. </li><li> Pipette 810 ml frisches Medium zu der unteren Kammer des Moduls Brunnen: fügen Sie es sorgfältig zwischen dem Einsatz und der Wand des Moduls gut. </li><li> Schließen Sie den Deckel und legen Sie das Gerät in den Inkubator. Schließen Sie das Gerät an seinem Computer; schalten Sie die Gerätesteuerung und die Software öffnen. </li><li> Wählen Sie &quot;neue Messung&quot; im Pop-up-Fenster. Check &#39;show TEER &quot;und&quot; show CCL-Boxen; und drücken Sie dann &quot;Start&quot;. Nach der ersten Messung abgeschlossen, wählen Sie &quot;überprüfen Sie alle Brunnen&quot; in der Registerkarte &quot;Ergebnisse&quot; alle TEER und Ccl Werte zu sehen. </li><li> Speichern Sie die Datei: Datei&gt; Speichern unter&gt; &#39;den Namen der Datei&#39;. HINWEIS: Als TEER und Ccl kontinuierlich in einer automatisierten Weise gemessen werden, deren Werte über einen Zeitraum von drei bis fünf Tagen zu überwachen. Mediumwechsel ist nicht erforderlich, es sei denn, die Lebensfähigkeit der Zellen suboptimal ist, wie durch eine fehlende Zunahme in TEER visualisiert. </li><li> Wählen Sie den Zeitpunkt zu Kokultur MBMECs mit Zellen T , wenn Ccl stabil ist und weniger als 1 &amp; mgr; F / cm 2 und TEER seinen Maximalpegel erreicht. </li><li> inspizieren sorgfältig absolute TEER und Ccl Werte und schließen Sie die Vertiefungen, in denen MBMECs nicht konfluent genug Monolayern von unchecking solche Brunnen entwickelt haben. </li><li> Gruppe der Rest aus den Brunnen der rechten Maustaste auf ein gut und wählen Sie &quot;Add gut an neue durchschnittlich gut&quot;. Name es in dem Pop-up-Fenster; das gleiche für alle einzelnen Vertiefungen zu gruppieren. </li><li> Überprüfen Sie alle durchschnittlichen Brunnen, um zu bestätigen, dass sie alle haben die gleichen Ausgangsbedingungen vor der Co-Kultur. Wenn einige signifikant unterschiedliche absolute TEER-Werte haben oder TEER abfällt, oder die Standardfehler zu groß sind, wiederholen Sie die Gruppierung. HINWEIS: Die optimale Gruppierung von Brunnen bietet minimale Variation in TEER-Werte, sowohl innerhalb als auch zwischen den Versuchsgruppen. </li><li> Im &quot;Experiment&quot; Registerkarte, drücken Sie &quot;Pause&quot;, trennen Sie das Gerät und nehmen Sie es aus dem Inkubator. Entfernen Sie die Deckel unter der Laminar-Flow-Haube. </li><li> Vorbereitung voraktiviert und / oder naiven T-Zellen, mit oder ohne spezifische Cytokine, Antikörper oder andere Substanzen, wie gewünscht: Zum Beispiel: gereinigtes mischen NA / LE Ratten-anti-Maus-IFN-γ-Antikörper (Klon XGM1.2) mit vorbereiteten T Zellen bei 20 &amp; mgr; g / ml pro Vertiefung des TEER Instruments. HINWEIS: Wenn Substanzen wie Granzym B-Inhibitor verwendet werden, sind sie einzu T Zellkultur dded zu Beginn der T - Zell - Stimulation: zB Granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) in einer Endkonzentration von 10 uM in DMSO mit isolierten T - Zellen gemischt. Siehe Materialien und Geräte für weitere Details. </li><li> Entfernen einen Teil des Mediums aus dem Einsatz (das obere Fach gut): zB vorsichtig pipettiert aus 150 ul (Entfernen all das Medium vermieden werden sollten , da sie die MBMEC einschichtigen stören könnte). </li><li> Hinzufügen T - Zellen zu MBMECs durch vorsichtiges Pipettieren von 150 ul Medium , enthaltend 2 x 10 5 Zellen / Insert. HINWEIS: Bei der Pre-aktivierte T-Zellen zu ernten, zählen nur Strahlen, Trypanblau-freien Zellen. </li><li> Schließen Sie den Deckel und legen Sie das Gerät wieder in den Inkubator. Schließen Sie das Gerät ein und drücken Sie &quot;Resume Messung&quot;. Nach 24 Stunden, drücken Sie &quot;Stop&quot; in der &quot;Experiment&quot; Registerkarte und speichern Sie die Datei (Datei&gt; Speichern). </li></ol> 5. Datenexport und statistische Analyse <ol><li>Exportieren Sie die Ergebnisse, indem Sie Datei&gt; Exportieren. </li><li> In der Registerkarte &quot;Einstellungen&quot; des Pop-up-Fenster, wählen Sie &quot;.dot&quot; in der &quot;Dezimaltrennzeichen&quot; -Option und &quot;Tabulator&quot; in der &quot;Feldtrennzeichen&quot; -Option. </li><li> In der &quot;Exportergebnisse&quot; Registerkarte benennen Sie die Datei, überprüfen Sie alle Brunnen exportiert werden, und überprüfen Sie die &quot;TEER&quot; und &quot;Ccl&quot; Boxen im &quot;wählen Daten&quot; aus. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Exportieren von Daten&quot;, öffnen Sie die exportierte Datei, und die Daten in eine Tabelle kopieren. </li><li> Normalisieren die exportierten Daten (durch jede Wiederholung sortiert, mit TEER und Ccl Werte für jeden Lauf (Messung gegeben)): Set TEER und Ccl Werte der letzten Zeitpunkt vor der Co-Kultur zu 100% und ändern entsprechend die Werte für alle anderen Läufe, bezogen auf die &#39;100%&#39; laufen. </li><li> Kopieren normalisierten Daten in eine Software der Wahl eines Graphen zu generieren, indem die einzelnen Vertiefungen und der Standardfehler des Mittelwerts für jede Behandlungsgruppe anzeigt. </li><li> Perform Zwei-Wege-ANOVA statistischen Test mit Bonferroni-Korrektur für multiple Vergleiche, die Statistik-Software der Wahl. </li></ol>

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl and L. Klotz have nothing to disclose. H.-J. Galla is a scientific advisor of nanoAnalytics GmbH, the manufacturer of the automated cell monitor.

Mehrere Schritte des beschriebenen Protokolls sind unerlässlich für ein erfolgreiches Experiment. Während der anfänglichen MBMEC Isolierung und Kultur, ist es entscheidend, dass Arbeiten unter sterilen Bedingungen, so viel wie möglich durchgeführt, um die Kontamination der Zellkultur mit Pilzsporen oder Bakterien zu verhindern. Um eine reine Kultur von ECs zu erhalten, wird empfohlen , ein Medium , das Puromycin für die ersten drei Tage zu verwenden, die das Überleben von ECs ermöglicht, nicht aber andere Zellt...

Die Blut-Hirn - Schranke trennt den systemischen Kreislauf aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) von 1 bis 3. Es stellt eine physikalische Barriere, die die freie Bewegung von Zellen und die Diffusion von wasserlöslichen Molekülen und schützt das Gehirn vor Krankheitserregern und potenziell schädlichen Substanzen hemmt. Zusätzlich zu seiner Barrierefunktion ermöglicht die BBB die Abgabe von Sauerstoff und Nährstoffen an das Hirnparenchym, das einwandfreie Funktionieren des neuronalen Gewebes gewährleistet. Funktionelle Eigenschaften der BHS durch ihre zellulären und azellulären Komponenten stark reguliert, mit hochspezialisierten ECs sein Hauptstrukturelement zu sein. ECs der BBB sind durch die Anwesenheit von tight junction (TJ) -Komplexe, der Mangel an fenestrations, extrem niedrige pinocytic Aktivität und permanent aktive Transportmechanismen aus. Andere Komponenten des BBB die EG Basalmembran, pericytes Einbetten des Endothels, astrozytären Ende Füße und = zugehöriges parenchymal Basalmembran tragen auch zur Entwicklung, Wartung und Funktion der BHS 2,4 - 6 und zusammen mit Neuronen und Mikroglia, bilden die neurovaskuläre Einheit (NVU), das reibungslose Funktionieren des ZNS 7 ermöglicht - 9. In einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen, wie von neurodegenerativen, entzündlichen oder Infektionskrankheiten wird die Funktion der BBB 2,5,10 kompromittiert. Dysregulation von TJ Komplexe und molekulare Transportmechanismen führt BHS-Permeabilität, Leukozytenextravasation, Entzündungen und neuronaler Schädigung erhöht. Um BBB Eigenschaften unter solchen pathophysiologischen Bedingungen, verschiedene in vitro BBB Modelle wurden 9,11,12 etabliert haben zu studieren. Gemeinsam haben sie wertvolle Einblicke in die Veränderungen der Integrität der Barriere, Permeabilität sowie Transportmechanismen zur Verfügung gestellt. Diese Modelle beschäftigen Endothelzellen von Mensch, Maus, Ratte, Schwein oder bSchafen Ursprung 13-18; primären endothelialen Zellen oder Zelllinien kultiviert werden entweder als Monokultur oder zusammen mit Perizyten und / oder Astrozyten , um genauer die BBB in vivo 19 nachzuahmen - 25. In den letzten Jahren Messung der transendothelialen elektrische Widerstand (TEER) hat Eigenschaften 26,27 ein weithin akzeptiertes Werkzeug zur Beurteilung Endothelbarriere werden. TEER reflektiert die Impedanz für den Ionenfluss durch die Zellmonoschicht und die Abnahme ein empfindliches Maß für kompromittiert endothelialen Integrität der Barriere und damit eine erhöhte Durchlässigkeit. Verschiedene TEER Messsysteme wurden entwickelt, darunter Epithelial Cell (Evom), E - Zell-Substrat - Impedanz - Mess (ECIS) und Echtzeit - Zellanalyse 15,28 - 30. TEER reflektiert den Widerstand gegenüber der Ionenfluss zwischen benachbarten ECs (parazellulärer Weg) und ist direkt proportional zu derBarriere Integrität. In der Impedanzspektroskopie 27,31, komplexe Gesamtimpedanz (Z) gemessen wird , die durch die Messung Ccl zusätzliche Informationen über die Integrität der Barriere zur Verfügung stellt. CCL bezieht sich durch die Zellmembran (transzelluläre Route) mit dem kapazitiven Strom: die Zellschicht wirkt wie ein Kondensator in der elektrischen Ersatzschaltung, die Ladungen auf beiden Seiten der Membran trennt und ist umgekehrt proportional zu der Barrierenintegrität. Wenn auf durchlässigen Einsätzen gewachsen, haften ECs, vermehren und die mikroporöse Membran verteilt. Dies widersteht dem Hintergrund kapazitive Strom des Einsatzes (das sich wie ein Kondensator wirkt), und führt zu einer Abnahme in der Kapazität, bis er seinen minimalen Pegel erreicht. Dies wird durch die Errichtung von TJ gefolgt Komplexe, die Dichtung aus dem Raum zwischen benachbarten ECs. Dies beschränkt den Ionenfluss durch den parazellulären Weg und TEER erhöht, bis es seine Plateau erreicht. Unter entzündlichen Bedingungen wird jedoch die endothelial Barriere beeinträchtigt: TEER abnimmt, wenn TJ erhalten gestört Komplexen und Ccl zunimmt, wenn die kapazitive Komponente des Einsatzes wieder ansteigt. Unsere TEER Messung nutzt die automatisierte Zellenüberwachung 32 System: Es folgt dem Prinzip der Impedanzspektroskopie und erweitert seine bisherigen Anwendungen. Hier beschreiben wir ein in vitro BBB Modell, das die Untersuchung der Barriereeigenschaften ermöglicht, einschließlich der Interaktion von Hirn Endothel mit Immunzellen; insbesondere aktivierte T-Zellen. 37 - solche pathophysiologischen Bedingungen sind bei Autoimmunerkrankungen des ZNS, wie Multiple Sklerose und seine Tiermodell experimenteller Autoimmun - Enzephalomyelitis 33 beobachtet. Hierbei ist ein entscheidender Schritt ist die Transmigration von enzephalitogenen, Myelin-spezifischen T-Zellen über die BBB. Dies wird durch die Reaktivierung im perivaskulären Raum und den Eintritt in das Hirnparenchym gefolgt, wo sie rekrutieren andere Immunzellen und mirschen Entzündung und anschließender Demyelinisierung 1,35,38. Jedoch molekularen Mechanismen der Wechselwirkung zwischen diesen T-Zellen und Endothelzellen, die wichtigsten Bestandteile der BBB, sind nicht gut verstanden. Unser Protokoll zielt darauf ab , diese Lücke zu füllen und neue Erkenntnisse über die Auswirkungen auf die Endothelzellen (dh Barriere Integrität und Permeabilität) auf ihren direkten Kontakt und komplexe Zusammenspiel mit aktivierten T - Zellen geben. Das hier beschriebene Protokoll nutzt primäre Mausgehirn mikrovaskulären Endothelzellen, als eine Monoschicht auf durchlässigen Einsätzen mit mikroporösen Membranen gewachsen. Endotheliale Zellen co-kultiviert mit CD4 + T - Zellen, die voraktiviert entweder polyklonal oder in einer Antigen-spezifischen Art und Weise werden kann. Co-Kultur von MBMECs mit voraktivierten, aber nicht naiver T-Zellen induziert eine Abnahme der TEER und eine Zunahme in CCl, die ein quantitatives Maß für die Störung MBMEC Dysfunktion und Barriere bereitstellt. Die Technikist nicht-invasiv: es statt chopstick Elektroden Einbau-Anwendungen, die große Störung der EC-Monoschicht zu verhindern; es kann Barrierefunktion zu überwachen, ohne die Verwendung von Zellmarker verwendet werden. Es macht kontinuierliche Messungen in einer automatisierten Weise und ermöglicht eine unabhängige Beurteilung der beiden Sperrparameter (TEER und CCL) gleichzeitig über die Zeit. Das Verfahren ist auch empfindlich genug, um zwischen verschiedenen Ebenen der T-Zellaktivierung und Wirkungen solcher T-Zellen auf ECs zu unterscheiden. Es kann in einem weiten Bereich von funktionellen Assays verwendet werden: verschiedene Cytokine und / oder bei entzündlichen Prozessen beteiligt Chemokine können zur Kokultur von MBMECs und T-Zellen hinzugefügt werden; Antikörper gegen Zelladhäsionsmoleküle entweder auf der EC oder T-Zellenseite Blockierung kann verwendet werden; und Inhibitoren der T-Zellaktivierungsmarker oder ihrer zytolytischen Eigenschaften können während der T-Zell-Priming oder deren Co-Kultur mit ECs hinzugefügt werden. Der Test ist auch nützlich für die T-Zell-TransmigrationsAssays, da es als Qualitätskontrolle der MBMEC einschichtigen Integrität vor der Zugabe von T-Zellen dienen kann. All dies macht diese Methode ein vielseitiges und zuverlässiges Werkzeug , um die BBB in vitro zu studieren, mit einem Fokus auf die Wirkung von aktivierten T - Zellen , die auf EC einschichtigen Integrität. Dies ist von besonderer Bedeutung für das Verständnis der Mechanismen der BBB Störung in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise MS und ihre EAE-Tiermodell, wo selbstreaktive, enzephalitogenen T-Zellen, die BBB durchqueren und Entzündungen und neuronalen Schäden führen.

<table><tbody><tr><td>cellZscope</td><td>nanoAnalytics GmbH</td><td>www.nanoanalytics.com</td><td>including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>www.thermoscientific.com</td><td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>www.beckmancoulter.com</td><td>for analysis of T cell transmigration</td></tr><tr><td>FlowJo7.6.5 software</td><td>Tree Star</td><td>www.flowjo.com</td><td>for analysis of T cell transmigration</td></tr><tr><td>Oak Ridge centrifuge tubes, PC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3118-0050</td><td>50 ml; for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Transwell membrane inserts - pore size 0.4 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>for TEER measurement as the main readout</td></tr><tr><td>Transwell membrane inserts - pore size 3 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay</td></tr><tr><td>24-well cell culture plate</td><td>Greiner</td><td>650 180</td><td>flat-bottom; for MBMEC culture</td></tr><tr><td>96-well cell culture plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>round-bottom; for immune cell culture</td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns</td></tr><tr><td>OctoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns</td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber</td><td>Marienfeld</td><td>MF-0640010</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Cell strainer, 70 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>MACS LS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>for T cell and B cell isolation</td></tr><tr><td>MACS MS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD4 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td>for CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD19 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-201</td><td>for B cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Collagen type IV from human placenta</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>for MBMEC coating solution</td></tr><tr><td>Fibronectin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>for MBMEC coating solution</td></tr><tr><td>Collagenase 2 (CSL2)</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase (C/D)</td><td>Roche</td><td>11097113001</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644-1L</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>DMEM (+ GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>for MBMEC and immune cell isolation</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>for MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>for MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>for MBMEC culture medium; only for the first three days</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>for harvesting MBMECs</td></tr><tr><td>Collagenase Type IA</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Trypan Blue solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>IMDM + 1% L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td>for T cell culture medium</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE04-418Q</td><td>protect from light; for B cell culture medium</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>for B cell culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>for B cell culture medium</td></tr><tr><td>mouse MOG&lt;sub&gt;35&amp;mdash;55 &lt;/sub&gt;peptide</td><td>Biotrend</td><td>BP0328</td><td>for antigen-specific T cell activation</td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD3 Ab</td><td>BioLegend</td><td>100302</td><td>clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation</td></tr><tr><td>purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab</td><td>BD Pharmingen</td><td>553294</td><td>clone 37.51; for polyclonal T cell activation</td></tr><tr><td>Recombinant Murine IFN-&amp;gamma;</td><td>PeproTech</td><td>315-05</td><td>for T-cell transmigration assays</td></tr><tr><td>Recombinant Murine TNF-&amp;alpha;</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td>for T-cell transmigration assays</td></tr><tr><td>NA/LE purified anti-mouse IFN-&amp;gamma; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>554408</td><td>clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Granzyme B Inhibitor II</td><td>Calbiochem</td><td>368055</td><td>recommended final concentration: 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD4 antibody</td><td>Biolegend</td><td>116005</td><td>clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration</td></tr></tbody></table>

an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Abbildung 1 gibt eine allgemeine Übersicht über die in vitro - Modell BBB die Wechselwirkung zwischen T - Zellen und Endothel - Zellen zu untersuchen verwendet. Das Experiment besteht aus drei Hauptschritten. Der erste Schritt ist die Isolierung von primären MBMECs aus Gehirnrinden, und ihre Kultur für fünf Tage. Wenn sie Konfluenz in der Zellkulturplatte zu erreichen, werden auf MBMECs permeablen Einsätzen trypsinisiert und reseeded, die in der TEER Instr...

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An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

an-vitro-model-blood-brain-barrier-using-impedance-spectroscopy-focus

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

11.2K Aufrufe.  University Hospital Münster. Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Serie: An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Forschung

Medizin

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Immunologie und Infektion

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Neurowissenschaften

Analyse von Blut-Hirn-Schrankenmodellen mittels Immunfluoreszenzfärbung

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung des Einsatzes von Tissue-Chip-Technologie für die Untersuchung von menschlichem Gewebe 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Biotechnik

Messung des transendothelialen Widerstands zur Beurteilung der Integrität der Zellbarriere

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Autor im Rampenlicht: Anwendungen der TEER-Detektion zur Beurteilung der Integrität der Zellbarriere 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

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Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion

Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion

Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion