Name: analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

1. خلية ثقافة الدماغ البشري خلايا الاوعية الدموية الدقيقة البطانية (HBMEC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء قوارير زراعة الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد حل فبرونيكتين، إضافة 10 مل PBS إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إضافة 150 ميكرولتر فبرونيكتين وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتغطية الجزء السفلي من T-25 زراعة الخلايا قارورة إضافة 2 مل من محلول فبرونيكتين. احتضان القارورة ثقافة الخلية لا يقل عن 3 ساعات في 37 درجة مئوية في الحاضنة. فبرونيكتين المغلفة قوارير يمكن تخزينها لمدة 2 أسابيع في 37 ° C / 5٪ CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذر والغرس وزراعة الخلايا من HBMEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل فبرونيكتين من أسفل القارورة ثقافة الخلية. إضافة 7.2 × 10 4 HBMEC / سم ² مع وقف التنفيذ في 6 مل ECM-ب المتوسطة (= ECM-ب تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، و 1٪ البطانية تكملة نمو الخلايا). احتضان عند 37 ° C / 5٪ CO 2. تحقق نمو الخلايا يوميا باستخدام المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسط ​​كل 3 أيام.الحصاد أو خلايا تقسيم، عندما HBMEC تصل إلى ما يقرب من 80٪ التقاء. وينبغي أن تستخدم HBMEC بين مرور 1 و 15 لتجنب فقدان الخصائص الفيزيولوجية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد HBMEC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد accutase حل عن طريق خلط accutase (1X) مع PBS في نسبة 1: 1. الحفاظ accutase الحل عند 37 درجة مئوية في حمام مائي حتى استخدامها مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ECM-ب المتوسطة من القارورة ثقافة الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. غسل HBMEC بإضافة 5 مل PBS إلى أسفل القارورة ثقافة الخلية. نضح PBS وكرر الخطوة غسل مرتين أخريين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة استعد قبل 2 مل accutase الحل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. بعد ذلك، HBMEC يتم إعادة وقف التنفيذ من خلال استغلال بقوة قارورة ثقافة الخلية عدة مرات. يتم التحكم مفرزة الخلية باستخدام المجهر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إضافة ECM-ب-المتوسطة المخزنة مسبقا في أنبوب 15 مل إلى قارورة زراعة الخلايا بمجرد بدء HBMEC إلى فصل. شطف أسفل القارورة بشكل متكرر حتى معظم HBMEC هيإعادة وقف التنفيذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في 1 مل ECM-ب متوسطة. عد الخلايا وتمييع تعليق الخلية لتحقيق تركيز النهائي من 3 × 10 5 HBMEC لكل مليلتر ECM-ب متوسطة. </li></ol></li></ol> 2. إعداد خلية ثقافة إدراجات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء من إدراج خلية ثقافة ملاحظة هامة: تجنب لمس الغشاء من إدراج ثقافة الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر حل فبرونيكتين (انظر 1.1.1) إلى كل إدراج ثقافة خلية (الشكل 1A) وبئر واحدة من 96-جيدا لوحة مسطحة القاع (مراقبة البصرية أيضا). احتضان لمدة لا تقل عن 3 ساعات في 37 ° C. بعد حل حضانة نضح فبرونيكتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر HBMEC تعليق على إدراج ثقافة الخلية والتحكم البصري أيضا. إضافة 600 ميكرولتر ECM-ب متوسطة إلى المقصورة أقل من الخليةإدراج الثقافة. احتضان لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 حتى سلامة الحاجز (الشكل 1B) يتم التوصل، تحقق نمو الخلايا عن طريق التقييم المجهري للHBMEC في السيطرة البصرية أيضا. ملاحظة: لا ينصح نمو الخلية وراء أربعة أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: لتحاكي حالات الالتهاب نضح المتوسطة من مقصورة الدنيا واستبدالها ECM-ب المتوسطة تستكمل مع 500 U / مل IFN-γ / TNF-α 24 ساعة قبل الفحص الهجرة. </li></ol></li></ol> 3. مراقبة الجودة مع ايفانز الأزرق يوم من الفحص التهجير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد إيفانز حل الأزرق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد PBS / B27 مزيج حل 10 مل PBS مع 200 ميكرولتر ملحق B27 باستخدام أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تمييع ايفانز الأزرق حل سهم (20 ملغ / مل PBS) 1: 1000 مع PBS / B27. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ايفانز الأزرق نفاذية فحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في المتوسط ​​من المقصورة أقل تليها المقصورة العليامن إدراج الثقافة خلية واحدة تحتوي على متكدسة HBMEC أحادي الطبقة. إضافة 100 ميكرولتر إيفانز حل الأزرق لإدراج الثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600 ميكرولتر PBS / B27 إلى المقصورة الدنيا واحتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 ° C / 5٪ CO 2. إزالة بعناية إدراج الثقافة الخلية باستخدام ملقط. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ايفانز قياس الأزرق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS / B27 من مقصورة الدنيا ونقل 100 ميكرولتر كل لبئرين من polystyrol الأسود 96-جيدا لوحة مسطحة القاع. إدراج لوحة في TECAN اللانهائي M200 القارئ برو لوحة وتحديد الأمثل ض الموقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإثارة قدر من ايفانز الزرقاء باستخدام إعدادات منها (على سبيل المثال: الإثارة: 620 نانومتر، والانبعاثات: 680 نانومتر، وعرض النطاق الترددي الإثارة: 9 نانومتر، عرض النطاق الترددي الانبعاثات: 20 نانومتر، وتعزيز 175x 25 ومضات، والوقت من التكامل: 20 ميكرو ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد وظائف حاجز HBMEC قارن حصلت البيانات إلى منحنى القياسية التي تصور إيفانز تخلل الأزرق عبر HBMEC في نقاط زمنية مختلفة بعد البذورجي الخلايا (الشكل 1B، يمين). </li></ol></li></ol> 4. هجرة الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل RPMI في أنبوب 15 مل الطرد المركزي وإضافة 200 ميكرولتر B27 الملحق. عد الخلايا PBMC وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. اعادة تعليق PBMC إلى التركيز النهائي من 5 × 10 6 خلية / مل RPMI / B27. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء لفحص الهجرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة من المقصورة أقل تليها المقصورة العليا من إدراج ثقافة الخلية التي تحتوي متموجة HBMEC الطبقات الوحيدة (الشكل 1A). لكل المانحة إضافة 100 ميكرولتر PBMC تعليق كل لإدراج زراعة الخلايا وكذلك لبئر واحدة من 24 لوحة جيدا في المائة (في المختبر السيطرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600 ميكرولتر RPMI / B27 إلى المقصورة السفلية من إدراج ثقافة الخلية و 500 ميكرولتر إلى PBMC للتحكم في المختبر واحتضان 6 ساعة عند 37 ° C / 5٪ CO 2. </lط&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد ترحيله PBMC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج إدراج الثقافة الخلية باستخدام ملقط وشطف بعناية أسفل مع 400 ميكرولتر PBS دون لمس الغشاء. تجاهل إدراج الثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر fluorospheres عدد التدفق (حوالي 1000 الخرز / ميكرولتر) إلى حجرة الأدنى من الثقافة خلية تضاف كذلك إلى عنصر التحكم في المختبر، وتخلط جيدا. نقل 1 مل من الناتج PBMC تعليق إلى التدفق الخلوي الأنابيب. </li></ol></li></ol> 5. التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي PBMC في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الضد بإضافة الأجسام المضادة تألقي مترافق إلى 100 ميكرولتر التدفق الخلوي عازلة (PBS / 1٪ BSA / 2 ملي EDTA) لكل عينة. للحصول على نتائج عرض أقل من 1 ميكرولتر CD4-FITC، استخدمت 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5، 1 ميكرولتر CD56-PC7، 1 ميكرولتر CD8-A700، و 1 ميكرولتر CD16-A750 في العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق PBMC في 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر التدفق الخلوي العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اكتساب عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق PBMC في المبلغ المطلوب (قد تختلف تبعا لقياس التدفق الخلوي المستخدمة) من التدفق الخلوي العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول الملون PBMC باستخدام قياس التدفق الخلوي مع كاشف النشط بين 525 و 700 نانومتر الطول الموجي للكشف عن fluorospheres عدد التدفق (الإثارة 488 نانومتر، وانبعاث 525-700 نانومتر). (الخطوات التالية هي مثال إذا تم استخدام تدفق Gallios عداد الكريات تعمل مع برنامج Kaluza G: (1) بدء تشغيل الكمبيوتر (2) عند تحميل نظام التشغيل بالكامل، وبدء قياس التدفق الخلوي عن طريق الضغط على &quot;عداد الكريات على&quot; الزر (3) تحميل بروتوكول اكتساب منها عن طريق الضغط على زر &quot;بروتوكول مفتوحة&quot;. (4) اختر البروتوكول المطلوب وحدد &quot;فتح&quot;. (5) مكررة بروتوكول لكل عينة عن طريق النقر على الحقزر الماوس على بروتوكول مرئية في دائري الظاهري واليسار انقر على حقل &quot;مكررة&quot;. (6) تسمية كل عينة في قائمة العينة. (7) نقل العينات إلى المواقع المحددة من دائري والبدء في عملية الاستحواذ.) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح التدفق الخلوي مما يؤدي البيانات باستخدام البرنامج منها. تحديد عدد من القطعان التي تهم transmigrated PBMC وكذلك خلايا في المختبر من آبار المراقبة وتدفق fluorospheres العد باستخدام برامج التحليل المعنيين. (تم اعطاء مثال للاستراتيجية المعزولة في الجزء النتائج (الشكل 1 C: تحليل التهجير من مجموعات فرعية NK الخلية، أولا تحديد الخلايا الليمفاوية في قناة مبعثر sideward (SSC) مقابل قناة مبعثر إلى الأمام (FSC) مؤامرة الخلايا اللمفاوية هي. ثم عرض في CD3 مقابل CD56 CD56 + المؤامرة وCD3 - يتم اختيار خلايا NK للتمييز بين مجموعات فرعية NK الخلية، يتم عرض الخلايا القاتلة الطبيعية فيويتم اختيار وكذلك CD56 CD16 + قاتمة خلايا NK - على CD56 CD16 مقابل المؤامرة وCD56 CD16 مشرق خافت /. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تحديد fluorospheres عدد التدفق من FSC مقابل SSC مؤامرة وبعد ذلك عرض في مؤامرة لقناة مع الانبعاثات بين 525 و 700 نانومتر مقابل الوقت لتحديد عددهم.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب عدد الخلايا الكلي لكل عينة، وتطبيع عدد الكشف عن الخلايا باستخدام fluorospheres عدد التدفق: <img alt="معادلة" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد النسبة المئوية للخلايا هاجر كما النسبة بين مجموع الخلايا هاجروا ومجموع الخلايا في عنصر التحكم في المختبر. </li></ol></li></ol>

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

هنا نقدم تقنية للتحقيق في التهجير من الخلايا الليمفاوية عبر حاجز الدم في الدماغ البشري. في تحليل المختبر الهجرة اللمفاويات إلى الجهاز العصبي المركزي هو مهم لدراسة العمليات الأساسية للتسرب الخلايا اللمفاوية، والتعديلات المحتملة المتعلقة بالمرض، وطرق علا?...

اللمفاويات الهجرة من الدم إلى الأنسجة أمر بالغ الأهمية لمراقبة المناعية. A سلسلة من التفاعلات الجزيئية محددة يضمن موقع التسرب معين في الأمعاء الدقيقة، والجلد والغدد الليمفاوية، والجهاز العصبي المركزي (CNS)، وغيرها من الأنسجة 1. وتشارك التعديلات في الهجرة لمفاوية في الفيزيولوجيا المرضية لعدد من الأمراض واسعة الانتشار 2. الهجرة إلى الجهاز العصبي المركزي المناعة متميز ينظم بإحكام وفقا لذلك تشارك التعديلات لهذه العملية في الأمراض المتصلة الجهاز العصبي المركزي مثل التهاب الدماغ والنخاع 3، البصري التهاب النخاع و الأعصاب، والسكتة الدماغية، والتصلب المتعدد (MS) 2، 4، 5، 6، 7. وبالتالي، فمن المهم دراسة لمفاوية تسرب إلى فهم أفضل الفيزيولوجيا المرضية المرض وتطوير أدوات ل<html> تحسين الاراضي من عبء المرض 8، 9، 10، 11، 12. الخلايا الليمفاوية تهاجر إلى الجهاز العصبي المركزي عبر طرق مختلفة. وقد وصفت التسرب من خلال الأوردة للشعيرات في الفضاء تحت العنكبوتية عبر حاجز السوائل الدم النخاعي داخل الضفيرة المشيمية وعبر حاجز الدم في الدماغ 1 و 13 و 14 و 15. تتم الهجرة عبر حاجز الدم في الدماغ عن طريق التفاعل بين الخلايا الليمفاوية مع الخلايا البطانية 14. وعلى النقيض من الخلايا البطانية في محيط الخلايا البطانية من CNS تعبر عن كميات عالية من جزيئات تقاطع ضيقة، مما يحد بدقة كمية من الخلايا والبروتينات قادرة على عبور حاجز الدم في الدماغمعشوقة = &quot;XREF&quot;&gt; 16. النتائج التهاب في تخفيف منعطفات ضيقة ويستحث التعبير عن جزيئات الالتصاق. وبالتالي، تعزيز الهجرة لمفاوية في الجهاز العصبي المركزي 1 و 17 و 18. تسرب عبر حاجز الدم في الدماغ هو عملية متعددة الخطوات. الخلايا اللمفية الحبل على الخلايا البطانية ثم لفة طول البطانة في عملية بوساطة أساسا selectins 1، 15. وفي وقت لاحق، والتفاعلات بين كيموكينات التي يفرزها البطانة والمستقبلات chemokine منهما أعرب عن الخلايا الليمفاوية تحدث تغييرات بتكوين لintegrins، وبالتالي تعزيز التصاق الثابت الخلايا البطانية 1. وأخيرا، الخلايا اللمفية إما الزحف على طول حاجز غشائي ضد تدفق الدم قبل transmigrating في الفضاء المحيط بالأوعية، أو المماطلة فورا ومباشرة نقل الحركةigrate في موقع شركة التصاق 1 و 19 و 20. ويمكن تحليل كل هذه الخطوات من تسرب الخلايا اللمفاوية في المختبر باستخدام تقنيات متميزة 21. ويستخدم الوقت الفاصل بين الفيديو المجهر لدراسة الربط الأولي والمتداول 15. توفر فحوصات التصاق معلومات مفصلة حول اعتقال الراسخ البطانية الحواجز 22. فحوصات التهجير كما هو موضح هنا تسمح بتحليل خلايا المناعة التهجير 21، 23، 24، 25، 26، 27، 28، 29. باستخدام البشرية في الدم في المختبر نموذج حاجز الدماغ، ونحن يمكن أن تظهر في الآونة الأخيرة أن migr العاليالقدرة atory من CD56 CD16 مشرق قاتمة / - خلايا NK مقارنة CD56 خافت انعكس CD16 + نظرائهم من غلبة هذا فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية في حجرة داخل القراب 21. وبالتالي، فإن الإعداد التجريبية يبدو أن تكون مناسبة لمحاكاة الوضع في الجسم الحي.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>without CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; or MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Fibronectin 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>from bovine plasma</td></tr><tr><td>T-25 cell culture flask</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell growth supplement</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>clear, 6.5 mm diameter, 3.0 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>96-well flat bottom plate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>stock solution: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x concentrated</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well black flat bottom plate</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Flow Count Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 10-color flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>clone N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>clone 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>clone RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>clone B9.11</td></tr></tbody></table>

analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier

لمفاوية تسرب في النظام العصبي المركزي (CNS) أمر بالغ الأهمية لمراقبة المناعية. التعديلات المتعلقة مرض تسرب الخلايا اللمفاوية قد يؤدي إلى تغيرات الفيزيولوجية المرضية في الجهاز العصبي المركزي. وهكذا، والتحقيق في هجرة الخلايا اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي مهم لفهم الأمراض CNS التهابات وتطوير طرق العلاج الجديدة. هنا نقدم نموذجا في المختبر من حاجز الدم في الدماغ البشري لدراسة الخلايا اللمفاوية التسرب. تزرع الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري الخلايا البطانية (HBMEC) confluently على البولي ايثلين مسامية transwell إدراج لتقليد البطانة من حاجز الدم في الدماغ. التحقق من صحة ظيفة الحاجز من قبل نطيقة النطيقة المناعية، والمقاومة الكهربائية transendothelial (طير) القياسات وكذلك تحليل إيفانز تخلل الأزرق. هذا النموذج يسمح التحقيق في انسلال من مجموعات فرعية لمفاوية نادرة مثل CD56 CD16 مشرق قاتمة / - خلايا NK. Furthermخام، وآثار الخلايا الأخرى، السيتوكينات و chemokines، التعديلات المتعلقة بالمرض، ونظم العلاج واضحة على قدرة المهاجرة من الخلايا الليمفاوية يمكن دراستها. وأخيرا، فإن تأثير محفزات للالتهابات وكذلك نظم العلاج المختلفة على حاجز غشائي يمكن تحليلها.

وتظهر نتائج الممثل تظهر التهجير من NK خلايا ومجموعات فرعية T-خلية باستخدام البشري الدم في الدماغ نموذج الحاجز (الشكل 1A). تم التحقق من صحة سلامة أحادي الطبقة HBMEC قبل تلطيخ من مفترق الطرق جزيء ضيق المقاومة الكهربائية القياسات (طير) transendothelial ZO-1، ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

20.3K Views.  University Hospital Münster. Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro. 

Video: Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Bioengineering

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

وضع ما يصل إلى<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الفئران حاجز الدم في الدماغ (BBB): التركيز على BBB عدم النفاذ والنقل مستقبلات بوساطة

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Medicine

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من حاجز الدم في الدماغ عن طريق التحليل الطيفي المعاوقة: التركيز على التفاعل خلية تي خلية البطانية

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

لوسيفر الأصفر - علامة نفاذية شبه خلوية قوية في نموذج خلية من حاجز الدم في الدماغ البشري

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

تقييم هجرة الخلايا الليمفاوية في نظام الهجرة فيفو السابقين

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

تحليل نماذج الحاجز الدموي الدماغي عن طريق تلطيخ التألق المناعي

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير استخدام تكنولوجيا رقائق الأنسجة لدراسة الأنسجة البشرية 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

استخدام منصة الأنسجة الحاجزة MicroSiM (μSiM) لنمذجة الحاجز الدموي الدماغي

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

<meta charset="utf8"></head><body>التصور القائم على صبغة الفلورسنت لانهيار الحاجز الدموي الدماغي في الفئران

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>تقييم انهيار الحاجز الدموي الدماغي في نموذج فأر لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

تقييم انهيار الحاجز الدموي الدماغي في نموذج فأر لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

وضع ما يصل إلى

ل

لوسيفر الأصفر - علامة نفاذية شبه خلوية قوية في نموذج خلية من حاجز الدم في الدماغ البشري

تقييم هجرة الخلايا الليمفاوية في نظام الهجرة فيفو السابقين

استخدام منصة الأنسجة الحاجزة MicroSiM (μSiM) لنمذجة الحاجز الدموي الدماغي

استخدام منصة الأنسجة الحاجزة MicroSiM (μSiM) لنمذجة الحاجز الدموي الدماغي

استخدام منصة الأنسجة الحاجزة MicroSiM (μSiM) لنمذجة الحاجز الدموي الدماغي

تقييم انهيار الحاجز الدموي الدماغي في نموذج فأر لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة

تقييم انهيار الحاجز الدموي الدماغي في نموذج فأر لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة