This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

1. Cell תרבות לתאי אנדותל כלי הדם המוח האנושי (HBMEC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של צלוחיות תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את הפתרון פיברונקטין, להוסיף 10 מ&quot;ל PBS כדי צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל. הוספת 150 μL פיברונקטין ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכסות את תחתית בקבוק תרבות תא T-25 להוסיף 2 מ&quot;ל של פתרון פיברונקטין. דגירת בקבוק תרבות תאים עבור 3 שעות לפחות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה. ניתן לאחסן צלוחיות מצופות פיברונקטין עבור 2 שבועות ב 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריעת תרבית תאים של HBMEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון פיברונקטין לשאוב מן החלק התחתון של בקבוק תרבית תאים. להוסיף 7.2 x 10 4 HBMEC / cm² מושעה 6 בינוני מ&quot;ל ECM-B (= ECM-B בתוספת 5% בסרום שור העובר, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ואת תוספת צמיחת תאים 1% אנדותל). לדגור על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2. בדוק צמיחת תאים יומי באמצעות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי המדיום כל 3 ימים.קציר או פיצול תאים, כאשר HBMEC להגיע לכ 80% המפגש. HBMEC אמור לשמש בין קטע 1 ו 15 כדי למנוע אובדן של מאפיינים פיסיולוגיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר HBMEC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן Accutase פתרון על ידי ערבוב Accutase (1x) עם PBS ביחס של 1: 1. שמור Accutase פתרון ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר בינוני ECM-b מבקבוק תרבות תא צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. לשטוף HBMEC על ידי הוספת 5 מ&quot;ל PBS לתחתית הבקבוק תרבית תאים. לשאוב PBS וחוזר על שלב הכביסה פעמים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מ&quot;ל 2 מחומם מראש Accutase פתרון. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. לאחר מכן, HBMEC מחדש תלוי בחוזקה על ידי קשה על בקבוק תרבית תאים מספר פעמים. ניתוק תא נשלט באמצעות מיקרוסקופ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ECM-ב-בינוני נשמרו קודם צינור 15 מ&quot;ל מתווסף בחזרה את הבקבוק תרבית תאים בהקדם HBMEC להתחיל לנתק. יש לשטוף את החלק התחתון של הבקבוק שוב ושוב עד ביותר HBMEC הםמושעה מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה XG 300 10 דקות בטמפרטורת החדר. בטל supernatant מחדש להשעות תאים 1 מ&quot;ל בינוני ECM-B. ספירת תאים לדלל את ההשעיה התא כדי להשיג ריכוז סופי של 3 x 10 5 HBMEC לכל מדיום ECM-b מ&quot;ל. </li></ol></li></ol> 2. הכנת התא מוסיף תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של מוסיף תרבית תאים הערה חשובה: אל תיגע הממברנה של מוסיף תרבית תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL פתרון פיברונקטין (ראה 1.1.1) לכל כנס תרבית תאים (איור 1 א) ו אחד טובה של צלחת 96-היטב שטוחה תחתונה (שליטה אופטית היטב). דגירה של 3 שעות לפחות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר פתרון פיברונקטין הדגירה לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL HBMEC השעיה לבית מוסיף תרבית תאי השליטה האופטית היטב. להוסיף 600 μl בינוני ECM-B לתא התחתון של התאמוסיף תרבות. הדגירה של 3 - 4 ימים 37 ° C / 5% CO 2 עד שלמות מחסום (1B איור) הוא הגיע, לבדוק צמיחת תאים על ידי הערכה מיקרוסקופית של HBMEC בבקרה האופטית היטב. הערה: צמיחת תאים מעבר ארבעה ימים אינה מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: כדי לחקות את התנאים דלקתיות לשאוב את המדיום מן המגירה התחתונה ולהחליפו בינוני ECM-B בתוספת 500 U / mL IFN-γ / TNF-α 24 שעות לפני assay את ההגירה. </li></ol></li></ol> 3. בקרת איכות עם כחול אוונס ביום של Assay גלגול נשמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון כחול אוונס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין PBS / B27 פתרון תערובת 10 מ&quot;ל PBS עם 200 μl תוסף B27 באמצעות צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל. לדלל פתרון מניות כחול אוונס (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PBS) 1: 1000 עם PBS / B27. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> assay חדירות הכחולה אוונס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מן המגירה התחתונה ואחריו התא העליוןשל כנס תרבות תא אחד המכיל בשכבת HBMEC ומחוברת. להוסיף 100 פתרון כחול μL אוונס אל הכנס תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 600 μL PBS / B27 לתא התחתון דגירה במשך 60 דקות ב 37 ° C / 5% CO 2. מוציאים בזהירות את הכנס תרבית תאים באמצעות מלקחיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידה כחולה אוונס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS / B27 מן המגירה התחתונה ולהעביר 100 μL בכל לשתי בארות של polystyrol שחור 96-גם צלחת תחתית שטוחה. הכנס צלחת בקורא צלחת פרו טקאן Infinite M200 ולקבוע z-מיקום אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עירור מדוד של הגדרות בהתאמה באמצעות כחול אוונס (למשל: עירור: 620 ננומטר, פליטת: 680 ננומטר, רוחב פס עירור: 9 ננומטר, רוחב פס הפליטה: 20 ננומטר, שיפור 175x, 25 הבזקים, זמן של אינטגרציה: 20 מיקרו-שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע פונקציות מחסום HBMEC להשוות רכשה נתונים כדי עקומת סטנדרט המתאר חלחול כחול אוונס ברחבי HBMEC בנקודות זמן שונות לאחר זרעתאי ing (1B איור, מימין). </li></ol></li></ol> 4. Assay הגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מ&quot;ל RPMI לתוך צינור 15 מ&quot;ל צנטריפוגה ולהוסיף 200 תוספת μL B27. ספירת תאי PBMC צנטריפוגות ב XG 300 5 דק &#39;. Re- להשעות PBMC לריכוז סופי של 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל RPMI / B27. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה של assay ההגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני מהתא הנמוך ואחריו התא העליון של מוסיף תרבית תאים המכילים monolayers HBMEC ומחוברות (איור 1 א). לפי התורם להוסיף 100 ההשעיה μL PBMC כל אל מוסיף תרבית תאים וגם אחד טוב של צלחת 24-היטב לכל (בשליטה במבחנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 600 μL RPMI / B27 לתא התחתון של מוסיף תרבית תאים 500 μL אל PBMC הבקרה במבחנה דגירה 6 שעות ב 37 ° C / 5% CO 2. </li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר שהועבר PBMC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את כנס תרבית תאים באמצעות מלקחיים ובזהירות לשטוף תחתון עם 400 μL PBS בלי לגעת הממברנה. מחק את כנס תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 20 μL זרימת ספירת fluorospheres (כ 1000 חרוזים / μL) אל המגירה התחתונה של תרבית תאים להכניס כמו גם לשליטה במבחנה ומערבבים היטב. העברת 1 מ&quot;ל של וכתוצאה ההשעיה PBMC לזרום cytometry צינורות. </li></ol></li></ol> 5. Cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה PBMC XG 300 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון נוגדן ידי הוספת נוגדני מצומדות fluorochrome כדי 100 μL cytometry זרימת החיץ (PBS / 1% BSA / 2 מ&quot;מ EDTA) לדגימה. לקבלת התוצאות המוצגות להלן 1 μL CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 μL CD56-PC7, 1 μL CD8-A700, ו 1 μL CD16-A750 שימשו לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות PBMC ב 100 μL של פתרון נוגדן דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 250 μL cytometry זרימה חיץ צנטריפוגות XG 300 5 דק &#39;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת המדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות PBMC בכמות הנדרשת (משתנה בהתאם cytometer זרימה בשימוש) של זרימת cytometry חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת PBMC צבעונית באמצעות cytometer זרימה עם גלאי אקטיבי בין 525 ו 700 ננומטר אורך גל לזהות fluorospheres זרימת הספירה (עירור 488 ננומטר, פליטת 525 - 700 ננומטר). (השלבים הבאים הם דוגמא אם זרימת Gallios cytometer המופעל באמצעות תוכנת Kaluza G משמשת:. (1) הפעל את המחשב (2) כאשר מערכת ההפעלה נטענת במלואו, להתחיל cytometer הזרים על ידי לחיצה על &quot;cytometer על&quot; כפתור . (3) טען את פרוטוקול רכישת בהתאמה ידי לחיצה על כפתור &quot;פרוטוקול פתוח&quot;. (4) בחר את הפרוטוקול נדרש ובחר &quot;לפתוח&quot;. (5) שכפל את הפרוטוקול עבור כל דגימה על ידי לחיצה עם ימיןעכבר כפתור על הפרוטוקול גלוי הקרוסלה הווירטואלית בלחיצה שמאלה על המגרש &quot;כפול&quot;. (6) סמן כל דגימה ברשימה המדגמת. (7) העביר דגימות העמדות המצוינות של הקרוסלה ולהתחיל הרכישה.) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרם פתוח וכתוצאה cytometry נתונים באמצעות התוכנה המתאימה. קביעת מספר תת-האוכלוסיות של ריבית transmigrated PBMC כמו גם תאי מבארות מלאות במבחנה ב וזרימת fluorospheres לספור באמצעות תוכנת ניתוח בהתאמה. (דוגמה לאסטרטגיה gating ניתנת בחלק התוצאות (איור 1 C: כדי לנתח גלגול תת NK תאים, בחר תחילה הלימפוציטים ערוץ פיזור ולצדדים (SSC) מול העלילה ערוץ פיזור קדימה (FSC) לימפוציטים הם. אז מוצג CD3 לעומת העלילה CD56 ו CD56 + CD3 -. תאי NK נבחרים כדי להבחין בין תת-תאי NK, תאי NK מוצגיםעלילה לעומת CD16 CD56 ו CD16 בהיר CD56 לעמעם / - כמו גם CD16 עמום CD56 + תאי NK נבחרים. בנוסף, fluorospheres ספירת זרימה נבחרו מתוך חלקת FSC מול SSC ובהמשך יוצג חלקת ערוץ עם פליטה בין 525 ו 700 ננומטר לעומת הזמן כדי לקבוע את מספרם.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את מספר התאים הכולל של כל דגימה, לנרמל למספר המזוהה של תאים באמצעות fluorospheres ספירת זרימה: <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת אחוז התאים נדדו כמו יחס בין תאים הכולל יועברו, תאים הכוללים בבקרה חוץ הגופייה. </li></ol></li></ol>

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

כאן אנו מציגים טכניקה לחקור גלגול לימפוציטים פני מחסום דם-המוח האנושי. בניתוח חוץ גופית של הגירה לימפוציטים אל CNS חשוב ללמוד תהליכים בסיסיים של extravasation הלימפוציטים, שינויים מחלות הקשורות פוטנציאל, גישות טיפוליות חדשות. שינו?...

הגירה לימפוציטים מהדם אל רקמות היא קריטית עבור מעקב חיסוני. רצף של אינטראקציות מולקולריות ספציפיות מבטיח extravasation באתר מסוים לתוך מעי דק, עור, בלוטות לימפה, מערכת העצבים המרכזית (CNS), ורקמות אחרות 1. שינויים הגירה לימפוציטים מעורבים בפתופיזיולוגיה של מספר מחלות פרושות לרווחה 2. הגירה אל החיסונית-חסוי CNS מוסדר בחוזקה ושינויים בהתאם התהליך הזה מעורבים במחלות הקשורות למערכת העצבים המרכזית כמו encephalomyelitis 3, neuromyelitis אופטיקה, שבץ, טרשת נפוצה (MS) 2, 4, 5, 6, 7. לכן, חשוב ללמוד extravasation הלימפוציטים להבין טוב יותר פתופיזיולוגיה המחלה ולפתח כלים עבור<html> צמחים וטיוב של מחלה 8 ניטל, 9, 10, 11, 12. לימפוציטים להגר לתוך CNS באמצעות מסלולים נפרדים. Extravasation דרך venules postcapillary לחלל תת-עכבישי דרך מחסום נוזל המוח והשדרה-דם בתוך מקלעת דמית ולרוחב את מחסום הדם-מוח תוארו 1, 13, 14, 15. הגירה דרך מחסום הדם-מוח מתבצעת על ידי האינטראקציה של לימפוציטים עם תאי אנדותל 14. בניגוד לתאי אנדותל בפריפריה, תאי אנדותל של CNS לבטא כמויות גבוהות של מולקולות צומת חזק, ובכך בהחלט להגביל את כמות התאים והחלבונים מסוגל לחצות את מחסום הדם-מוחנַעֲרָה = &quot;Xref&quot;&gt; 16. תוצאות דלקת התרופפות של צמתים הדוקים ומשרה את הביטוי של מולקולות הדבקה; ובכך, שיפור הגירה לימפוציטים לתוך CNS 1, 17, 18. Extravasation דרך מחסום הדם-מוח הוא תהליך רב שלבי. לימפוציטים לקשור את תאי האנדותל ואז לגלגל לאורך האנדותל בתהליך בתיווך בעיקר על ידי selectins 1, 15. לאחר מכן, אינטראקציות בין וכמוקינים מופרשים על ידי האנדותל ואת קולטני chemokine בהתאמה הביעו על לימפוציטים לגרום לשינויים קונפורמציה של integrins, ובכך לקדם הדבקת חברת אל תאי אנדותל 1. לבסוף, לימפוציטים או זחילה לאורך המכשול אנדותל נגד זרימת הדם לפני transmigrating לחלל perivascular, או לעכב באופן מיידי וישיר Transmigrate באתר של הדבקת חברת 1, 19, 20. כל הצעדים הללו של extravasation הלימפוציטים ניתן לנתח במבחנה באמצעות טכניקות ברורות 21. זמן לשגות מיקרוסקופ וידאו משמש ללמוד את הקשירה הראשונית מתגלגל 15. מבחני הדבקה לספק מידע מפורט על מעצרו משרד אנדותל מחסומים 22. מבחני גלגול נשמות, כפי שהודגם כאן מאפשרים ניתוח של גלגול חיסוני תאים 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. שימוש האנושי במודל מחסום דם המוח במבחנה, אנו לאחרונה יכולים להראות כי migr גבוהקיבולת atory של CD16 הבהיר CD56 לעמעם / - תאי NK לעומת CD56 שלהם עמום CD16 + עמיתיהם שהתבטאו דומיננטיות של תת תא זה NK בתא intrathecal 21. לפיכך, הגדרת הניסוי שלנו נראה מתאים לחקות את המצב vivo.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>without CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; or MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Fibronectin 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>from bovine plasma</td></tr><tr><td>T-25 cell culture flask</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell growth supplement</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>clear, 6.5 mm diameter, 3.0 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>96-well flat bottom plate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>stock solution: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x concentrated</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well black flat bottom plate</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Flow Count Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 10-color flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>clone N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>clone 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>clone RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>clone B9.11</td></tr></tbody></table>

analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier

extravasation לימפוציטים לתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא קריטי עבור מעקב חיסוני. מחלות הקשורות שינויים של extravasation הלימפוציטים עלול לגרום לשינויים פתופיזיולוגיים של מערכת העצבים המרכזית. לפיכך, החקירה של הגירה לימפוציטים לתוך CNS חשוב להבין מחלות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית ועל מנת לפתח גישות טיפול חדשות. כאן אנו מציגים מודל במבחנה של מחסום דם-מוח האדם ללמוד extravasation הלימפוציטים. המוח כלי הדם אנוש תאי אנדותל (HBMEC) גדלים confluently על terephthalate פוליאתילן נקבובי Transwell להכניס לחקות האנדותל של מחסום הדם-מוח. תפקוד המחסום אומת על ידי אימונוהיסטוכימיה occludens zonula, ההתנגדות החשמלית Transendothelial (TEER) מדידות כמו גם ניתוח של חלחול כחול אוונס. מודל זה מאפשר חקירה של diapedesis של תת הלימפוציטים נדירים כגון CD16 בהיר CD56 לעמעם / - תאי NK. Furthermעפרות, את ההשפעות של תאים אחרים, ציטוקינים chemokines, שינויים הקשורים למחלות, ועל משטרי טיפול מובחנים על יכולת הנדידה של לימפוציטים ניתן ללמוד. לבסוף, את ההשפעה של גירויים דלקתיים כמו גם משטרי טיפול שונים על מחסום אנדותל ניתן לנתח.

תוצאות נציג מראה גלגול NK-התא תת T תאים בעזרת מודל מחסום הדם-מוח אנושי (איור 1 א) מוצגים. היושרה של monolayer HBMEC תוקף של הכתמה של המולקולה בצומת דוק ZO-1, התנגדות חשמלית Transendothelial (TEER) מדידות, וכן חלחול הכחול אוונס (איור 1B). בעקבות 3 - 4 ימי התרבות...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

20.3K Views.  University Hospital Münster. Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro. 

Video: Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Bioengineering

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Medicine

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

לוציפר צהוב-מרקר חזק הקרנף מסמן במודל תא של מכשול הדם האנושי-מוח

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

ניתוח מודלים של מחסום דם-מוח באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

מחבר זרקור: קידום השימוש בטכנולוגיית שבבי רקמות לחקר רקמות אנושיות 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

<meta charset="utf8"></head><body>הדמיה מבוססת צבע פלואורסצנטי של פירוק מחסום דם-מוח בעכברים

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>הערכה של התמוטטות מחסום דם-מוח במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית קלה

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

הערכה של התמוטטות מחסום דם-מוח במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית קלה

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

הגדרה למעלה

לוציפר צהוב-מרקר חזק הקרנף מסמן במודל תא של מכשול הדם האנושי-מוח

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח

הערכה של התמוטטות מחסום דם-מוח במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית קלה

הערכה של התמוטטות מחסום דם-מוח במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית קלה