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Bewahren Sie alle Meerwasser oder künstlichem Meerwasser (SW), erwachsenen Tieren und Kulturen bei 15 ° C, so viel wie praktisch. Stellen Sie sicher, Eier und Zygoten sind in SW eingetaucht gehalten. Kommerziell hergestellte Meersalz mit destilliertem oder Umkehrosmose Wasser wiederhergestellt dient auch als Quelle der SW. Überprüfen Sie den Salzgehalt mit einem Hydrometer und stellen Salze oder Wasser, um ein optimales Niveau zu erreichen. Halten spezifische Gewicht Niveaus zwischen 1,020 bis 1,025. Bewahren Sie alle Glas-und Kunststoffprodukte getrennt von dem übrigen Laborgeräte, um eine Kontamination mit Chemikalien zu vermeiden. Embryo Grade Laborgeräte sauber durch Spülen mit VE-Wasser oder gelegentliche Einweichen in verdünnter Natriumhypochlorit gefolgt von Spülen mehrmals in Wasser. 1. Gewinnung und Reifung Gameten aus Patiria miniata Erwachsene <ol><li> Wählen Sie ein Tier Gonaden herauszuschneiden. Bestimmen Sex nach der Exzision durch die Suche nach der Gegenwart der Eierstöcke oder Hoden, weil P. miniata sind nicht an sichxually dimorphic. </li><li> Schneiden eine kleine Öffnung, die nicht größer als 1 cm, entlang der Seite von einem Seestern Arm mit einer Skalpellklinge (1A). Mit Hilfe von kleinen stumpfen Enden Zange das Zurückziehen der Schnittkanten der Gonaden Gewebe für den Zugriff auf und ziehen Gonaden Gewebe durch den Einschnitt. HINWEIS: Vermeiden Sie es, aus Darmgewebe, die eine lose grau oder braun Gewebe (Abbildung 1B) ist. Eierstöcke sind in der Regel orange, gelb oder hellbraun (1C), während die Hoden sind weiß oder beige und wenn gestört wird dazu führen, Meerwasser milchig oder trüb, im Aussehen (Abbildung 1D) zu werden. </li><li> Zurück zu den Frauen Aquarien. Isolieren Männchen um ein oder zwei Stunden in einen Behälter mit SW seit dem Stress aus Laich Handhabung kann zu induzieren. Tiere heilen entlang der Einschnittstelle und weiter zu Gameten für mehrere Monate zur Verfügung stellen. </li><li> Sammeln Hoden in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit so wenig wie möglich und SW Lagerung auf Eis bis zum Gebrauch. Bewahren Sie die Hoden nicht wired am Tag der Entnahme bei 4 ° C für bis zu einer Woche. </li><li> Sammeln Eierstöcke in einem kleinen Glas Kulturschale in einem mehrere Milliliter SW. Um die Eizellen aus dem Eierstock Gewebe freizugeben, necken neben das Gewebe mit zwei Pinzetten, bis keine großen Stücke bleiben. HINWEIS: Optimal ist die Mehrheit der Oozyten voll entwickelt. Solche Eizellen sind groß, rund und klar, gelb oder hellbraun mit einem deutlichen Keimbläschen in der Eizelle (2A), im Vergleich zu der Untergruppe der nicht entwickelten Eizellen, die kleiner, braun, körnig und opak (2B) sind. Wenn mehr als rund 25% der Eizellen sind von unentwickelten Vielfalt, wählen Sie eine andere weibliche Eizellen zu erhalten. </li><li> Gießen Sie die Eizellen und verbleibende Gewebe durch ein Sieb mit einer Filtertasse 200 um Porengröße und sammeln durch fließen. Dadurch werden alle Sorten von Eizellen enthalten, aber Eierstockgewebe zu entfernen. Verdrängen verbleibenden Oozyten aus dem Gewebe durch das Filter gefangen durch Sprühen wit SW aus einer Spritzflasche. Filtertassen werden mit einem 50 ml konischen Röhrchen (3A-A &#39;) hergestellt. </li><li> Gießen Sie die Strömung durch aus Schritt 1.6 durch ein 100 um Maschenfiltertasse. Verwerfen kleinen Eizellen bei der Durchströmung. Große voll entwickelten Eizellen, die bereit für die Reifung wird auf dem Filter zu bleiben. Spülen Sie die Oozyten in einen sauberen 200-ml-Becher. </li><li> Fügen Sie 95 ml SW auf den 200 ml-Becherglas von Eizellen. 5 ml von 200 uM 1-Methyladenin zu einer Endkonzentration von 10 uM. </li><li> Übertragen Sie die Eizellen zu einem großen flachen Kulturschale und Ort bei 15 ° C. Eine hohe Oberfläche zu Volumen Kulturschale ermöglicht den Sauerstoffaustausch. Die Eizellen reifen nicht oder nicht gut entwickeln, wenn sie in dieser Reifephase überfüllt sind. Aufgeteilt in mehrere Gerichte der SW plus 10 uM 1-methlyadenine bis Kultur ist weniger als 200 Eizellen / ml. </li><li> Lassen Sie die Oozyten für 45-90 min reifen, aber nicht mehr, da dies die Eizellen nicht in der Lage zu sein, machen fertilized. Um festzustellen, ob die Reifung abgeschlossen ist, bei der Eizellen schauen unter einem Binokular. Die Keimbläschen bewegt sich auf und verschmilzt mit der Zellmembran während der Reifung. Es bricht dann nach unten und ist nicht mehr in reifen Oozyten (Abbildung 2C) sichtbar daher. </li></ol> 2. Die Befruchtung der Eizellen Ältere <ol><li> Wählte eine kleine Gruppe von Hodengewebe, etwa erbsengroße und Hackfleisch in einem kleinen Glas Kulturschale mit etwa 1 ml SW. </li><li> Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette auf 2-3 Tropfen der resultierende milchige Meerwasser auf etwa 100 ml der reifen Eizellen übertragen und wirbeln die Kulturschale zu mischen. Vermeiden Sie die Übertragung Stücke von Hodengewebe. Vermeiden Sie es größere Mengen an Spermien, da dies zu Polyspermie und anschließende schlechten Entwicklung führen. </li><li> Nach einigen Minuten beobachten die Eizellen unter einem Binokular. Befruchtete Eier oder Zygoten, eine Befruchtung Umschlag, der eine klare Blase, die aus dem cel erhebt, istl Membran (2D). HINWEIS: Nicht mit der Kultur vor, wenn weniger als etwa 90% der Eier zu befruchten, da schlechte Befruchtungsraten sind ein Hinweis auf eine ungesunde Kultur, die auch nicht gut entwickeln kann. </li><li> Nach der vollständigen Befruchtung ist, ändern Sie die SW auf den Zygoten von Gießen durch einen 100 um Sieb-Filter und Spülen in eine Kulturschale mit frischem SW. Es ist wichtig, die überschüssige Spermien Sauerstoffmangel zu verhindern entfernen. Legen Sie die Kulturschale bei 15 ° C für 15-30 min. </li></ol> 3. De-Geliermittel und Rudern befruchteten Eier <ol><li> Vorbereitung Injektion Gerichte, indem Sie den Deckel von einem 60 x 15 mm Petrischale aus Polystyrol. <ol><li> Zeichnen Sie einen Permanent-Marker Stiftlinie auf der Rückseite der Schale, um den Bereich, den Bereich der Blick auf die Mikroinjektion Mikroskop passt. Dies stellt sicher, dass alle gerudert Embryonen im Mikroskop Feld. </li><li> Verwenden Sie ein Glas Pasteur-Pipette, um eine Linie durch den Kreis, S. punktenreferably zu einer Seite des Kreises (3B). Verwenden Sie diese Linie später Injektionsnadeln (Schritt 4.5) zu brechen. HINWEIS: Reagenzien häufig verwendet, um Seeigel-Embryonen, zB Protaminsulfat oder Poly-L Lysin, sind unnötig halten. De-Sülze P. miniata Zygoten haften sehr gut auf unbeschichteten Kunststoff. Beachten Sie, dass sie nicht gut zu Glasschalen bleiben. </li></ol></li><li> Fügen etwa 10 ml SW zu jeder Schale, so daß die Oberfläche bedeckt, aber das Wasser wird nicht zu spritzen in die Schale, da dies reihig Embryonen stören. </li><li> Entfernen Sie die P. miniata Zygote Gallerthülle mit Säure SW vor Rudern. Diese Gallerthülle ist umfangreicher als die für Modell Seeigel-Arten beobachtet. <ol><li> Bereiten Säure SW im Bereich von pH 4,0 bis 4,2. Der pH-Wert ist entscheidend für die effiziente Entfernung von Gallerthülle, gestattet jedoch eine normale Entwicklung. </li><li> Fügen Sie einzelne Tropfen von 1 N (1 M) HCl in SW zu einem 1 L Lager von SW. Lassen Sie jeder Tropfen vollständig mischenund zu überwachen, bevor Sie mehr pH-HCl. HINWEIS: Ein bis mehr ml HCl ergibt die entsprechenden pH-Wert, aber nicht das gesamte Volumen auf einmal hinzuzufügen. HINWEIS: Bereiten 1 N HCl in Abzug mit SW-und 12 N (12 M) HCl. </li><li> Entfernen SW auf Zygoten durch Gießen Sie sie auf einen 100 um Sieb-Filter. Spülen Sie in einen 200-ml-Becher in die kleinste Menge von SW möglich (ca. 10 ml). Das Becherglas wird bis zu 150 ml mit Säure SW (pH 4,0) und damit die Zygoten in die Säure SW 3 min stehen. </li></ol></li><li> Streifen Gallerthülle von den Zygoten von ihnen Gießen hin und her zwischen zwei 200 ml-Becher, jedes Mal vorbei an den Zygoten durch ein 200 um Sieb-Filter. Gießen Sie die Zygoten durch den Filter um 5-10x über ca. 2 min Zeitfenster. </li><li> Säure zu entfernen, indem die SW Zygoten auf einen 100 um Sieb-Filter. Spülen Sie die Zygoten in eine kleine Glasschale mit Kultur SW. De-Sülze Zygoten können Kunststoffschalen bleiben. Reihe Embryonen sofort; sie beginnen, mehr zu produzieren jElly Mantel, die schlechte Haftung der Zeit führt zu Kunststoffschalen. </li><li> Verwenden Sie einen Mund Pipette (3C-C &#39;) von der Kulturschale Glas abholen Zygoten und legen Sie sie in geraden Linien auf den Einspritz Gerichte. Schmelzen Sie die Mitte der dünnen Seite einer Pasteur-Pipette über einer Flamme, bis das Glas weich ist. Schnell ziehen Sie die Enden der Glas auseinander, um eine sehr dünne Strecke von Glas zu produzieren. Sobald das Glas abgekühlt ist, brechen Sie das kleine Ende des Pasteur-Pipette (für weitere Informationen auf die Vorbereitung ein Mund Pipette sehen Wessel et al., 2004 17 oder Süß et al., 2004 18). <ol><li> Machen Sie ein Ruder Pipette so dass der Durchmesser ist nur größer als der Durchmesser der Embryonen, so dass nur eine einzige Zygote wird betreten und verlassen die Pipette zu einer Zeit. Dies ermöglicht eine einzige Reihe zu bilden. Kleineren Durchmesser Pipetten können die Befruchtung Hülle abstreifen und stören die Zygoten als P. miniata Zygoten nicht über eine hyaline Membran einnd sind recht weich. </li><li> Wenn die Zygoten nicht auf die Kunststoffschale kleben, halten sie nicht für zusätzliche Zeit in Säure SW (bis zu mehreren Minuten). Alternativ kann ein kleiner Durchmesser Pipette kann bei der Beseitigung von Gallerthülle, damit die Zygoten, um effektiver halten zu helfen. </li><li> Die Zygoten sind leicht positiven Auftrieb und neigen dazu, zu schwimmen oder schweben knapp über dem Boden der Schale. In diesem Fall, positionieren Sie den Ruder Pipette, so dass die Zygoten werden sanft auf die Oberfläche der Schale wie sie aus der Pipette (3D) gedrückt. HINWEIS:. Es ist zulässig, viele Zeilen auf diesen Gerichten passen P. miniata embryonalen Membranen werden erst schwieriger, im Laufe der Zeit durchdringen und daher kann man Hunderte von Zygoten auf einem einzigen Gericht zu injizieren. </li></ol></li></ol> 4. Die Injektion von Zygotes <ol><li> Bereiten Injektionslösungen mit geeigneten Konzentrationen von Morpholino Antisense-Oligonukleotide (MASO), mRNA oder DNA in einer Endkonzentrationentration von 200 mM KCl. 400-800 uM MASO und 2,5 ng / ul DNA neigen dazu, morphanten Phänotypen bei gleichzeitiger Verringerung Toxizität. Die Endkonzentration in dem Ei 1/125 ten Ausgangskonzentration 14 sein. Injektionslösungen, die masos, Hitze auf 65 ° C für 5 min unmittelbar vor der Verwendung und bei Raumtemperatur lagern. <ol><li> Zur Vereinfachung der Sortier injizierten Embryonen, fügen Rhodamin Dextran Tracer zu der Injektionslösung in einer Konzentration von 0,1% zu erhalten. </li></ol></li><li> Bereiten Injektionsnadeln durch Ziehen Glaskapillarröhren (1,0 mm AD x 0,75 mm ID, 100 mm Länge) in einer Nadel ziehen Instrument folgenden Anweisungen des Herstellers. Geeignet für Injektionsnadeln in Seeigel auch gut für Seesterne, so verwenden ähnliche Parameter 19. </li><li> Legen Sie etwa 2 ul Injektionslösung in einer Injektionsnadel mit einem Microloader Pipettenspitze. </li><li> Legen Sie die stumpfe Ende der Nadel in den manipulator. Stellen Picospritzer zu 100 ms Puls und einen Luftdruck von 40 PSI. </li><li> Legen Sie ein Gericht aus Embryonen ruderte auf den Mikroskoptisch und haben alle Embryonen in Feld. Orientierung der Schale, so dass die Ritzlinie auf der Seite am nächsten zu der Nadel. Positionieren Sie die Nadel in einem ca. 60 ° Winkel, so ist die Spitze in der Nähe der Mitte der Linie und knapp über der Oberfläche des Wassers. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf der eingekerbten Linie und Senken der Nadel, bis die Spitze in den Fokus kommt. Senken Sie die Spitze ein wenig mehr und brechen sie, indem Sie sie sanft in die Rippen der Ritzlinie geöffnet. Heben Sie die Spitze von der Oberfläche der Schale und wird es an der Spitze der ersten Reihe der Zygoten und konzentrieren sich auf die Zygoten. </li><li> Senken Sie die Spitze, so dass es das Zentrum der Zygote kam und in um einen Winkel von 60 ° aufspießen. Die Nadel dringt leicht P. miniata Zygoten. Schritt auf das Fußpedal (oder andere Mittel aus der Injektionsnadel zu zwingen Material), einen Bolus von inje einführenction Lösung in den Embryo. </li><li> Ziel für einen Bolus, die 20-30% ist der Durchmesser des Embryos oder zwischen 25 und 80 pl. Wenn der Bolus größer oder kleiner ist als diese, Einstellen der Einspritzzeit auf der Picospritzer und injizieren das nächste Embryo. Weiter, um die Dauer einzustellen, um die gewünschte Bolus Größe zu erhalten. Beginnen bei 100 ms Dauer. Re-Break die Nadel, wenn mehr als etwa 200 ms benötigt wird, um die entsprechende Bolus einzuführen. Entsorgen Sie die Nadel und bereiten eine neue, wenn weniger als 15-20 ms benötigt wird, um diese Größe zu erhalten Bolus, wenn die Nadel ist zu groß und kann die normale Entwicklung stören. </li><li> Gehen Sie, um die restlichen Zygoten an der Einspritz Gericht zu injizieren. Embryonen kann leicht bis Spaltung beginnt und in einzelne Blastomeren nach der ersten Spaltung injiziert werden. Regelmäßig heben Sie die Nadel über der Oberfläche des Wassers zu Zygoten, die auf die Nadel stecken zu entfernen. Falls erforderlich, erneut brechen die Spitze der Nadel oder laden Sie eine neue Nadel, wenn eine Blockade auftritt. </li></ol><ol><li> Lassen Sie die Embryonen bei 15 ° C in SW zu entwickeln. Aufrechterhaltung einer hohen Oberfläche zu Volumen in den Kulturen um den Sauerstoffaustausch ermöglichen. Stellen Sie sicher, Embryonen sind nicht überfüllt; Kulturen halten bei oder unter 200 Embryonen / ml. Je nach dem gewünschten Stadium der Embryo, planen injizierten Embryonen bei etwa 20-24 Stunden nach der Befruchtung zu sammeln. HINWEIS: Dies ist oft eine ideale Zeit, zu sortieren und zu sammeln, und weil in der Regel entwickelnden Embryonen leicht morphologisch unterscheiden, sind aber noch nicht schwimmen. </li><li> Wenn Embryonen geschlüpft, vorsichtig salzen Schock für Schwimmen verhindern. Geben Sie 200 ul 5 M NaCl auf 10 ml SW in der Einspritz Gericht unter leichtem Schwenken der SW. Nach ein paar Minuten werden die Embryonen auf den Boden der Schale fallen. Sammeln diese und verschieben Sie sie in den normalen Salzgehalt SW. </li><li> Sammeln injizierten Embryonen unter einem geeigneten Fluoreszenzlichtquelle mit dem Tracer im INJEKTIERT kompatibelon-Lösung. Wenn kein Tracer verwendet wurde, sortieren Embryonen für normale Morphologie zu wählen. </li><li> Mit dem Mund ansaugen, ziehen fluoreszierende Embryonen mit einer minimalen Menge von SW und blasen sie in eine kleine Kulturschale mit SW gefüllt. Ideal Mund Pipetten haben eine ausreichend große Öffnung für Embryonen und herausgezogen werden, ohne diese zu beschädigen, aber nicht so groß, dass unerwünschte Fremd Embryonen und SW sind ebenfalls nach oben gezogen wird. </li><li> Sobald alle gewünschten Embryonen wurden in die neue Schale gesammelt, beobachten die Embryonen unter Fluoreszenzlicht und entfernen Sie alle un-injizierten Embryonen oder schlecht entwickelte Embryonen. </li><li> Kultur sortiert Embryonen, um die gewünschten Stufen in einem Inkubator und fahren Sie mit Bildgebung oder anderen gewünschten Protokolle. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt von den Autoren.

Es gibt zwei wichtige Schritte, die schwierig für unerfahrene Anwender dieser Technik sind aber unerlässlich für die erfolgreiche Schaffung morphanten Embryonen. Die erste ist die Auswahl gesunder Eizellen, die reifen und richtig düngen wird. Der Prozentsatz der normalen Entwicklung in einer Kultur hängt von der Jahreszeit, der Gesundheit des Tieres, und die Anzahl der Male, die Oozyten wurden aus einem einzigen Individuum geerntet. Eizellen sind in der Regel von besserer Qualität von April bis Oktober. Es ist wic...

Das Sea Star, Patiria miniata, (allgemein als die Fledermaus Stern) ist als eine interessante und vielseitige Modellsystem Schwellen für eine Vielzahl von Mobil 1-3, Entwicklungs 4,5, Evolutions 6 bis 8 und 9 bis 11 ökologische Studien. Erwachsene P. miniata entlang der Pazifikküste von Sitka, Alaska nach Baja, Kalifornien 12 verteilt sind und leicht in Meerwasseraquarien gehalten. Eizellen sind erhältlich jährig und jedes Weibchen kann Zehntausende von Eiern zu vergießen. Eizellen sind leicht gereift und außen 13 befruchtet. Die daraus resultierenden Embryonen sind durchsichtig erlaubt eine einfache Beobachtung; entwickeln sie synchron und erfordern nur Meerwasser für die Entwicklung. Gesamte Genom Montage und mehrere Transkriptomen sind auch für P. verfügbar miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Solche Vorteile machen sie ideal für eine Reihe von Forschungsund Lehrzwecke. In den letzten Jahren P. miniata hat sich zu einem Modellsystem für die Entwicklungs genregulatorischen Netzwerkanalysen 14-16. Ziel solcher Untersuchungen ist die gesamte Komplement regulatorischen Gene zu identifizieren und zu bestimmen, die das Netz ihre Wechselwirkungen. Ein großer Teil dieser Arbeit bringt störenden Genexpression durch Einführung von Antisense-Oligonukleotide oder in vitro synthetisierten mRNA. Zusätzlich sind cis-regulatorischen Analysen verwendet werden, um die Funktion von regulatorischen DNA 15 charakterisieren. Diese Analysen erfordern Einführung Störungs Reagenzien und / oder DNA-Reporterkonstrukte in Embryonen. Ferner sind die nachgeschalteten Effekte dieser Störungen zu charakterisieren, muß man viele Embryonen zu Veränderungen in der Genexpression potentieller Ziele zu untersuchen. Verfahren zur Mikroinjektion von vielen Hunderten von Zygoten sind von zentraler Bedeutung für diese Arbeit. Stachelhäuter, darunter P. miniata </em&gt;, erfordern viele Monate bis zur Geschlechtsreife zu erreichen. Aus diesem Grund ist es im allgemeinen nicht praktisch, zu entwickeln und aufrechtzuerhalten transgenen Linien dieser Tiere für Experimente. Daher kann die Zucht von transgenen Erwachsene nicht effizient geändert Embryonen erstellen. Stattdessen müssen Störung auftreten, de novo durch Mikroinjektion. Mikroinjektion bietet die Möglichkeit, Embryonen mit Reagenzien, die nicht zellgängig sind zu ändern. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren, um DNA, mRNA, Zell Tracer und Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden in Hunderten von befruchteten Eiern in einer 2-3 h durch Mikroinjektion sitzt einzuführen. Dies erzeugt genügend Material für eine Vielzahl von stromabwärts Experimente, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, qPCR beschränkt, in-situ-Hybridisierung, RNA-Seq und Western Blotting.

<table><tbody><tr><td>1-Methyladenine</td><td>Acros Organics (Fisher Scientific)</td><td>AC20131-1000</td><td></td></tr><tr><td>190 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0185-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>100 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0105-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing</td><td>FHC, Inc</td><td>30-30-0</td><td>For pulling microinjection needles</td></tr><tr><td>Model P-97 Needle Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Rhodamine Green</td><td>Life Technologies</td><td>D7163</td><td>If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Also available in many pet stores</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr></tbody></table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Stachelhäuter haben lange für die Untersuchung von Gen-Regulation und Evolution von Entwicklungsprozessen ein beliebtes Modellsystem für die Untersuchung der Fortpflanzung und Entwicklung, und in jüngerer Zeit. Das Sea Star, Patiria miniata, gewinnt Prävalenz als Modellsystem für diese Art von Studien, die bisher fast ausschließlich in den Seeigel, Strongylocentrotus purpuratus und Lytechinus variegatus durchgeführt wurden. Ein Vorteil dieser Modellsysteme ist die Leichtigkeit der Herstellung von modifizierten Embryonen, bei denen ein bestimmtes Gen ist nach oben oder unten reguliert, Markierung einer Gruppe von Zellen, oder Einführen eines Reportergens. Eine einzelne Mikroinjektionsverfahren ist in der Lage eine Vielzahl von solchen modifizierten Embryonen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Gewinnung von Gameten aus P. miniata, Herstellung Zygoten, und die Einführung von störenden Reagenzien über die Mikroinjektion. Gesunde morphanten Embryonen werden anschließend für die quantitative und qualitative Studien von GE isoliertne Funktion. Die Verfügbarkeit von Genom und Transkriptom Daten für diesen Organismus die Arten von Untersuchungen, die durchgeführt werden und die Leichtigkeit der Ausführung von ihnen erhöht.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Reagenzien in Embryonen vor. Wir zeigen die Wirksamkeit des Protokolls durch die Injektion eines DNA-Reporterkonstrukt, das die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) antreibt. Injizierten Embryonen exprimieren GFP in klonalen Patches (4A-B), da die DNA enthält im frühen Spaltung. Viele Reagenzien, die wünschenswert, in Embryonen einzuführen sind, sind in hohen Mengen und zu suboptimalen Chargen von Embryonen toxisch. Toxizität manifestiert durch Ver...

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A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methoden, die morphanten Embryonen sind unerlässlich, um Entwicklungsmechanismen und Gen-regulatorische Netzwerke zu studieren. Das Sea Star Patiria miniata ist ein aufstrebendes Modellsystem für diese Studien. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Erhalt von Gameten erzeugende Kulturen von Embryonen und schnelle Mikroinjektion von Zygoten von dieser Spezies.

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

a-method-for-microinjection-of-patiria-minata-zygotes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

10.9K Aufrufe.  Carnegie Mellon University.  Methoden, die morphanten Embryonen sind unerlässlich, um Entwicklungsmechanismen und Gen-regulatorische Netzwerke zu studieren. Das Sea Star Patiria miniata ist ein aufstrebendes Modellsystem für diese Studien. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Erhalt von Gameten erzeugende Kulturen von Embryonen und schnelle Mikroinjektion von Zygoten von dieser Spezies. 

Serie: A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Lasergestützte Zytoplasmatischen Mikroinjektions in Vieh Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Forschung

Genetik

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Entwicklungsbiologie

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Mikroinjektionsmethode für Anopheles gambiae Embryonen

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Zygoten-Mikroinjektion zur Erzeugung von Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Allelen in Mäusen

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

Mikroinjektionsverfahren für Zebrabärblings-Embryonen

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von

Zusammenfassung

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