Die Autoren danken Dr. Dick Campbell (UC Irvine) für Gespräche über das ursprüngliche Protokoll zur Erstellung und Pflege von nervenfreien Tieren, Frau Rui Wang für Hilfe bei der Anpassung der Spritzen- und Nadeltechnik und Frau Danielle Hagstrom und Dr. Rob Steele (UC Irvine) für Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von der RCSA und NSF Grant CMMI-1463572 unterstützt.

1. Doppelte Colchicin-Behandlung <ol><li> Machen Sie eine 0,4% Colchicin (Gewicht / Volumen) Lösung in Hydra Medium 3 , 4 , 17 . Achtung: Colchicin ist akut toxisch, tödlich, wenn es verschluckt wird, kann genetische Defekte verursachen und kann Augenschäden verursachen. Behandeln Sie das Pulver in einer Dunstabzugshaube und tragen Sie volle persönliche Schutzausrüstung (PSA). </li><li> Inkubation Hydra vulgaris (AEP-Stamm wurde hier verwendet), die für 24 h in 0,4% Colchicin in einem Verhältnis von 5 Hydra pro ml Colchicin-Lösung in einer Petrischale für 8 h bei Raumtemperatur im Dunkeln verhungert wurden. Hinweis: 5 Hydra / mL Colchicin ist ein Leitfaden für die Bestimmung, wie viel Lösung zu verwenden, um zu vermeiden Überfüllung der Schale mit Hydra . Verwenden Sie für nachfolgende Reinigungs- und Lösungsänderungen das gleiche Lösungsvolumen. </li><li> Entfernen Sie die Colchicinlösung und ersetzen Sie sieMit sauberem Hydra Medium ohne Colchicin. Waschen Sie die Hydra 5 mal durch serielle Übertragung mit einer Glaspasteurpipette in ein sauberes Hydra- Medium, bevor Sie auf 50 μg / ml Rifampicin in Hydra- Medium übertragen werden. Hydra in einem 18 ° C Inkubator halten. Anmerkung: Ausreichend 1.000X Rifampicin-Stamm (50 mg / ml) in Dimethylsulfoxid (DMSO) für 1-2 Wochen Behandlung kann bei 4 ° C gelagert werden. Die genaue Menge kann durch das Gesamtvolumen der täglich verwendeten Lösung bestimmt werden. Zum Beispiel, wenn es 2 Gerichte gibt, die jeweils 10 ml Lösung enthalten, die zweimal täglich gewechselt werden muss, werden an einem Tag insgesamt 40 mL Lösung verwendet, was 40 μl 1.000X Lager pro Tag oder 560 μL entspricht Über einen Zeitraum von zwei Wochen. Der Bestand wird dann 1: 1000 in Hydra- Medium nach Gebrauch verdünnt. Achtung: DMSO ist eine brennbare Flüssigkeit und dringt leicht in die Haut ein, so dass andere gelöste Chemikalien in den Körper gelangen. HandLe das Lösungsmittel in einer Abzugshaube und tragen volle PSA. DESSO friert bei 4 ° C ein </li><li> Ändern Sie das Rifampicin-haltige Hydra- Medium zweimal täglich, bis die Hydra stoppt, Zellen in das Medium zu vertreiben, was in der Regel 1 Woche nach der Behandlung ist. Zu diesem Zeitpunkt kann das Medium einmal täglich gewechselt werden. Während der Tage nach der Behandlung wird die Hydra ihre Tentakeln komplett verlieren. Vermeiden Sie es, die Hydra in Kontakt zu haben, da sie zusammenschmelzen und zu seltsam geformten Hydra führen können ( Abbildung 2 A ). <ol><li> Um den Kontakt zu vermeiden, vermeiden Sie, die Schale in einer kreisförmigen Bewegung zu verwirbeln. Stattdessen schütteln Sie die Schale in vertikaler und horizontaler Richtung vorsichtig, bis die Hydra auseinandergespreizt sind. Überprüfen Sie die Schale, wenn Sie die Hydra in den 18 ° C Inkubator stellen und wie nötig einstellen. Hinweis: Für die Tage, in denen das Medium zweimal geändert wird, wechseln Sie das MediumEinmal morgens und wieder nachmittags / abends </li></ol></li><li> Sobald die Tentakel anfangen zu bilden, beginnen Sie mit der Zwangsernährung und zerreißen die Hydra 3 bis 4 mal pro Woche (siehe Abschnitte 2 und 3). Etwa 8-9 Tage nach der Colchicin-Behandlung wird die Hydra beginnen, ihre Tentakeln zurück zu wachsen. Hinweis: Tentakel Nachwachsen variiert unter den Individuen. Einige können länger als 8 - 9 Tage dauern, bevor sie Zeichen des Tentakelwachstums zeigen. Diejenigen, die ihre Tentakeln nicht nachwachsen, sowie merkwürdig geformte ( Fig. 2 B ) Tiere oder Tiere, die zu klein sind, um zu füttern, sollten entfernt werden. Diese Hydra wird wahrscheinlich nicht die zweite Behandlung überleben. Die Hydra kann auch Knospe. Allerdings können einige der Knospen noch interstitielle Zellen haben und in der Lage sein, auf eigene Faust zu essen. <ol><li> Entfernen Sie alle Knospen, die ohne Hilfe essen und vom Elterntier abnehmen können. Identifizieren Sie diese Tiere durch Hinzufügen von Live Artemia an dieFütterung Gericht und beobachten, ob die Tiere fangen und essen die Artemia auf eigene Faust. 1 oder 2 Hydra kann auch in der Lage sein, auf eigene Faust zu essen. Diese sollten auch verworfen werden. Anmerkung: Nervenfreie Hydra haben eine charakteristische Ballon-ähnliche Morphologie und Tentakeln, die kürzer und dünner als normal sind (aufgrund des Verlustes von Nematocyten) und können so leicht von normal aussehenden Tieren unterschieden werden ( Abbildung 1 A, 1B ). </li></ol></li><li> Drei Wochen nach der ersten Colchicinbehandlung wiederholen Sie die Colchicinbehandlung (Schritte 1.1 - 1.5). Eine zweite Colchicin-Behandlung ist notwendig, um die verbleibenden Zwischenzellen und Nervenzellen zu eliminieren 3 . </li></ol> 2. Zwangsernährung <ol><li> Fügen Sie Artemia Zysten zu einem schmalen und hohen Glasbehälter hinzu, der sich am Boden verjüngt. Füllen Sie den Behälter mit Artemia Wasser (6,72 M NaCl). Vermeiden Sie exce1 g Zysten pro 1 l Wasser für eine höhere Luke ausgeben. <ol><li> Die Oberseite des Behälters mit Parafilm abdecken und eine 10 mL serologische Pipette durch den Parafilm in den Behälter geben. Belüftung durch Anbringen von Schläuchen an eine Aquarium-Luftpumpe und Montage der Schläuche um die Pipette. Vergewissern Sie sich, dass die Pipettenspitze den Boden des Behälters erreicht und dass keine Zysten am Boden liegen. Die Artemia schlüpft nach 48 h. Hinweis: Es gibt viele verschiedene Möglichkeiten, Artemia zu schlüpfen, die genauso gut funktionieren können. </li></ol></li><li> Die Artemia aus dem Artemia- Wasser in einem Artemia- Netz (erhältlich von Aquarien-Versorgungsunternehmen) abbauen und für ca. 20 s in DI-Wasser waschen, bevor sie in eine Schale mit Hydra- Medium gebracht werden. Der Salzgehalt von Artemia Wasser ist zu hoch für Hydra , so dass die Artemia gewaschen werden muss, bevor sie verwendet werden. </li><li> Unter einem Sektionsmikroskop,Töte die Artemia, indem du sie leicht mit einem Paar feiner Pinzette drückst. Vermeiden Sie es, hart genug zu drücken, um den Mut zu vertreiben, da dies an der Pinzette haften und die Fütterung schwierig machen wird. Die Artemia, bevor sie es der Hydra zuführt, leicht zu quetschen, wird bei der Verdauung helfen. 14 Lege die frisch getötete Artemia in die Nähe der Hydra in die Schale, um die schnelle Fütterung zu erleichtern. Hinweis: Alle nachfolgenden Schritte werden unter einem Sektionsmikroskop durchgeführt. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette, um die Hydra am Stiel zu halten. Setzen Sie fort, den Stiel während des Prozesses der Fütterung der Hydra zu halten . Mit einem zweiten Paar Pinzette, klemmen Sie die Körpersäule, um die Hydra Vertrag zu machen. </li><li> Während man die Spitzen der zweiten Pinzette zusammenhält, tippe in der Mitte des Hypostoms (die gewölbte Struktur am oralen Ende des Tieres). Dies führt manchmal dazu, dass sich der Mund öffnet. ichDer Mund öffnet sich nicht durch Klopfen, punktiert den Mund, indem er die Pinzette in die Mitte des Hypostoms einsetzt und dann den Druck auf die Spitzen der Pinzette leicht löst. Das sollte die Mundöffnung durch die Punktion ausstrecken. Anmerkung: Die Hydra kann entleeren und zusammenbrechen, wenn der Mund geöffnet ist ( Abbildung 2 C ). Wenn dies geschieht, kann die Artemia noch in die Hydra eingefügt werden. Wenn es zu schwierig ist, dies zu tun, fahren Sie auf die nächste Hydra und kehren zu der ursprünglichen Hydra einige Zeit später und versuchen Sie es erneut. Die Hydra neigen dazu, bei nachfolgenden Mundöffnungen nicht so viel zu entleeren. </li><li> Richten Sie Artemia schnell mit der Pinzette auf und stecken Sie sie in die Magenhöhle der Hydra ein . Setzen Sie so viele Artemia wie möglich ein, bis die Magenhöhle voll ist und mehr Artemia kann nicht eingefügt werden, ohne die Hydra , Unfall zu beschädigenVerbinden Sie alle Artemia im Inneren, oder verhindern, dass der Mund zu schließen. Im Durchschnitt ist dies 5 - 6 Artemia , aber bis zu 12 wurden den größeren Tieren gefüttert. <ol><li> Wenn der Mund zu schließen beginnt, dehnen Sie sich mit der Pinzette wie oben beschrieben wieder auf; Allerdings sollte Vorsicht geboten werden, da irgendeine Artemia bereits innerhalb des Tieres beginnen kann, herauszukommen, wenn der Mund wieder geöffnet wird. </li><li> Wenn die Hydra für eine ganze Artemia zu klein ist, schneide die Artemia mit einem Skalpell und füttere die Hydra kleinere Stücke. Wenn die Artemia nicht in der Hydra bleibt, kann es notwendig sein, die Pinzette gegen die Artemia zu drücken, um sie in der Hydra zu halten, bis ihr Mund schließt. </li></ol></li><li> Übertragen Sie gefütterte Hydra mit einer Glaspasteurpipette sorgfältig, um versehentliches Aufstoßen zu vermeiden, auf eine Schale mit frischem 50 μg / ml Rifampicin in Hydra- Medium. Wenn eine Artemia vertrieben wurde fRom der Hydra während der Übertragung, reinsert es, während in der neuen Schale. Anmerkung: Eine Glaspipette wird verwendet, um die Hydra zu übertragen, wie es gefunden wurde, dass Hydra weniger zu Glas im Vergleich zu Plastik klebt. Die Länge der Pipette spielt keine Rolle, aber mit 5-Zoll-Pipetten kann etwas einfacher sein. </li></ol> 3. Burping <ol><li> Burp die Hydra , um unverdaute Material jederzeit zwischen 8 und 20 h nach der Fütterung zu entfernen. </li><li> Schieben Sie den Punkt einer 30G-Injektionsnadel mit P320 oder ähnlichem Sandpapier, bis die Spitze flach ist. Anmerkung: Eine 27G-Injektionsnadel würde auch funktionieren, aber die kleinere Spitze der höheren Lehre ist vorzuziehen. </li><li> Befestigen Sie die Nadel mit einer 1 ml Plastikspritze und füllen Sie die Spritze mit frischem 50 μg / mL Rifampicin in Hydra Medium. Hinweis: Das Saugen einer einzelnen Hydra dauert ca. 0,05 ml bis 0,1 ml Lösung. Ein 1 mL syriNg ist bevorzugt, da die Steuerung der Kraft und des Volumens der auskommenden Lösung mit einer größeren Volumenspritze schwieriger ist. </li><li> Unter einem Seziermikroskop halten Sie den Stiel der Hydra mit feiner Pinzette und klopfen Sie in die Mitte des Hypostoms mit der Nadel. Wenn sich der Mund nicht öffnet, führe die Pinzette in den Hypostom ein und öffne den Mund, wie oben beschrieben für die Fütterung. Hinweis: Alle nachfolgenden Schritte werden unter einem Sektionsmikroskop durchgeführt. </li><li> Verwenden Sie die Spritze zu spülen, sehr sanft zu vermeiden, wegblasen das ganze Tier, die Magenhöhle mit der 50 μg / ml Rifampicin-Lösung bis alle Trümmer wurde vertrieben. Die Nadel muss nicht unbedingt in die Hydra eingesetzt werden, wenn die Größe der Hydra nicht zulässt. Die Nadel kann in der Nähe der Mundöffnung gehalten werden und zeigte direkt auf den Mund. </li><li> Mit einer Glas-Pasteur-Pipette, überragt Hydra auf eine Schale mit frischen 5081; g / ml Rifampicin in Hydra- Medium. </li></ol> 4. Qualitätskontrolle über Immunhistochemie ANMERKUNG: Das folgende Protokoll wird von Protokollen von Shenk, M. A, et al. 18 und Böttger, A 19 . Alle Schritte werden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Ein Nutator kann für die Inkubationsschritte verwendet werden und kann die Färbequalität verbessern. Allerdings, wenn die Hydra sich miteinander verheddern, können alle Schritte auch ohne durchgeführt werden. <ol><li> Vorbereiten der Sperrlösung: 10% fötales Rinderserum (FBS) und 1% DMSO in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Lagern Sie diese Lösung bei 4 ° C bis zur Anwendung (Schritte 4.6 und 4.11). Die Lösung kann für 1 - 2 Tage gelagert werden. Hinweis: Alle in diesem Protokoll verwendeten Lösungen müssen ordnungsgemäß als gefährlicher Abfall gesammelt werden. </li><li> Entspannter Hydra in 200 μl 2% urethan in Hydra mEdium für 1 min in 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie 5 Hydra pro Röhrchen für jede der 4 Bedingungen: nervenfrei, unbehandelt, unbehandelt ohne primären Antikörper und unbehandelt ohne sekundären Antikörper. Hinweis: 1 min nicht überschreiten. Das Timing hier ist kritisch, da die Tiere in schlechter Form sein werden, nachdem sie zu viel Zeit in Urethan verbracht haben. </li><li> Entfernen Sie das Urethan und fixieren Sie die Hydra in 200 μl 4% Paraformaldehyd (PFA) in Hydra- Medium für 15 min. </li><li> Waschen Sie die Proben 3 mal mit 1x PBS für jeweils 10 min. Hinweis: Alle Wäschen mit PBS und PBSTx werden mit 500 μl Lösung durchgeführt. </li><li> Permeabilisieren mit 500 μl 0,5% Triton X-100 in PBS für 15 min. </li><li> Entfernen Sie die 0,5% Triton X-100 und fügen Sie 500 μl der Sperrlösung hinzu. Blockieren Sie die Proben für mindestens 1 Stunde. </li><li> Verdünnen Sie den Anti-Tyrosin-Tubulin-Antikörper 1: 200 in Blockierungslösung. Anmerkung: Diese Konzentration war deExperimentell behandelt. Wenn das Signal in den Kontrollen zu schwach ist, kann die Konzentration möglicherweise erhöht werden. Wenn es unspezifische Bindung gibt, muss die Konzentration vermindert werden. Die Vorinkubation des Antikörpers kann auch dazu beitragen, die unspezifische Bindung zu reduzieren. </li><li> Entfernen Sie die Sperrlösung aus den Proben und fügen Sie 200 μl des primären Antikörpers der nervenfreien Hydra , unbehandelten Kontrollen und unbehandelten Kontrollen ohne Sekundär hinzu. Für die unbehandelten Kontrollen ohne primäre, nur 200 μl Blockierungslösung ohne den Antikörper hinzufügen. </li><li> Die Proben über Nacht (&gt; 12 h) bei 4 ° C inkubieren. Hinweis: Alternativ 5 - 6 h bei RT inkubieren. </li><li> Den primären Antikörper entfernen und die Proben weitgehend mit 0,3% Triton X-100 in 1x PBS (PBSTx) waschen. Hinweis: Sparen Sie den primären Antikörper und lagern bei 4 ° C, da er mindestens 2 - 3 mal wiederverwendet werden kann. </li><li> Verdünnung von Ziegen-Anti-Maus-HP-Sekundär-AntibiotikaOdy 1: 500 in Blockierlösung Füge 200 μl zu der nervenfreien Hydra , unbehandelten Kontrollen und unbehandelten Kontrollen ohne Primär. Für die unbehandelten Kontrollen ohne Sekundär, nur 200 μl Blockierungslösung ohne den Antikörper hinzufügen. Hinweis: Alternativ kann ein fluoreszierender sekundärer Antikörper verwendet werden, für den die Schritte 4.13 - 4.17 nicht benötigt werden. Die Verwendung einer fluoreszierenden Sekundärspalte spart Zeit und ist in der Regel ausreichend, aber die hP-Sekundärseite bietet eine erhöhte Empfindlichkeit. Die Sekundärkonzentration wurde experimentell bestimmt. Wenn die Signale in den Kontrollen zu schwach sind, kann die Konzentration möglicherweise erhöht werden. Wenn es unspezifische Bindung gibt, muss die Konzentration vermindert werden. </li><li> Die Proben über Nacht bei 4 ° C inkubieren. </li><li> Entfernen Sie den sekundären Antikörper und waschen Sie die Proben weitgehend mit PBSTx. </li><li> Bereiten Sie 1x PBT: 0,2% Rinderserumalbumin (Gewicht / Volumen) und 0,05% Tween20 in 1x PBS vor. Inkubiere die sAmples in 1x PBT für 30 min. </li><li> Entfernen Sie die 1x PBT und inkubieren Sie die Proben in 1: 1000 NHS-Fluorescein und 1: 10.000 H 2 O 2 in 1x PBT für 15 min im Dunkeln. Von diesem Schritt aus, halten Sie die Proben im Dunkeln so viel wie möglich, da das Fluoreszenzsignal sinkt, wenn sie Licht ausgesetzt sind. Anmerkung: NHS-Fluorescein wurde nach einem detaillierten FISH-Protokoll von King, RS und Newmark, PA 20, hergestellt </li><li> Die Proben 3 mal mit PBSTx schnell waschen, dann 2 mal für 30 min. </li><li> Lassen Sie die Proben in PBSTx über Nacht bei 4 ° C, um weiter zu waschen. </li><li> Noch ein paar Wäsche mit 1x PBSTx. Um Zellkerne zu visualisieren, führen Sie die folgenden optionalen Schritte zur DNA-Gegenfärbung mit 4 &#39;, 6-Diamindino-2-phenylindol, Dihydrochlorid (DAPI) durch. Andernfalls können die Proben jetzt abgebildet werden. </li><li> 5 mg / ml DAPI-Stamm auf eine Arbeitskonzentration von 1: 500 in PBSTx verdünnen und jedem Röhrchen 200 μl zugeben. IncuBate die Proben für 30 min. Achtung: DAPI ist ein bekanntes Karzinogen. Tragen Sie volle PSA. </li><li> Entfernen Sie das DAPI und waschen Sie die Proben 2 - 3 mal mit PBSTx vor der Imaging mit Fluoreszenzmikroskopie. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hydra interstitielle Zellen können durch eine Doppel-Colchicin-Behandlung 3 , 4 eliminiert werden. In den Tagen nach der ersten Behandlung ist es entscheidend, den Kontakt zwischen der einzelnen Hydra zu verhindern, um die Verschmelzung von Hydra- Stücken in deformierte Hydra zu vermeiden. Auch Tiere, die nach der ersten Behandlung unbeaufsichtigt essen können, müssen entfernt werden, da die zweite Colchicinbehandlung nich...

Das Nervensystem von Hydra besteht aus einem Nervennetz, wobei Neuronen mit beiden Epithelgewebeschichten 1 assoziiert sind. Das Nervennetz ist dichter im Hypostom und Stiel und weniger dicht in der Körpersäule 2 . Die Nervenzellen stammen aus interstitiellen Stammzellen, die multipotenten Stammzellen sind, die zu sekretorischen Zellen, Nematocyten, Keimzellen und Neuronen führen. Es ist möglich, die interstitiellen Zellen von Hydra vulgaris durch die Behandlung mit Colchicin 3 , 4 , ein pflanzliches Toxin, das trennenden Zellen zu beseitigen, zu eliminieren. Obwohl Colchicin die Mikrotubulus-Polymerisation in anderen Organismen verhindert hat, hat eine frühere Studie gezeigt, dass Mikrotubuli in Hydra während der gesamten Behandlung vorhanden sind, was darauf hindeutet, dass Colchicin dies nicht in Hydra 3 bewirkt. Ein anderer stUdy schlägt vor, dass Colchicin in einigen Organismen nicht effizient an Tubulin bindet, wie Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas und Schizosaccharomyces pombe, was diesen Unterschied erklären kann 5 . Die Colchicin-Behandlung induziert die Phagozytose der interstitiellen Zellen durch die endodermalen Epithelzellen 3 und ermöglicht somit die Entstehung von Tieren, denen Nervenzellen, Drüsenzellen und Nematocyten fehlen. Es ist unklar, warum die interstitiellen Zellen besonders anfällig für Colchicin-Behandlung sind. Angesichts der Tatsache, dass sowohl post-mitotische interstitielle Zellen als auch die interstitielle Stammzelllinie beschädigt und phagozytiert sind, kam Campbell zu dem Schluss, dass Colchicin die Mitoseaktivität nicht direkt beeinflusst hat 3 . Bemerkenswert ist, dass die Colchicin-Behandlung in Hydra vulgaris gut funktioniert , aber es wurde gezeigt, dass sie auch bei anderen Spezies, wie Hydra oligactis 6 , nicht funktioniert . </Em&gt; Eine modifizierte Behandlung mit Colchicin und Hydroxyharnstoff kann zur Herstellung von nervenfreier Hydra viridis 7 verwendet werden . Nervenfreie Hydra (auch manchmal als &quot;Epithel- Hydra &quot; 8 bezeichnet ) sind daher ein nützliches Hilfsmittel für die Untersuchung der Rollen dieser spezialisierten Zelltypen aus der interstitiellen Zelllinie in Geweihhomöostase und Regeneration. Hydra kann das einzige bekannte Beispiel eines Tieres sein, das ohne Nervensystem leben kann. Nervenfreie Hydra dienen als besonders nützliches Modell für die Sezierung der Rolle des Nervenetzes bei der Regulierung der Hydra- Regeneration, Homöostase und Verhalten. Zum Beispiel erlaubte die Einführung von interstitiellen Zellen in nervenfreie Hydra über Pfropfen die Charakterisierung der Nervenzelldifferenzierung als hochregionsspezifische 9 . Darüber hinaus, weil nervenfreie Hydra regenerieren können, sieErmöglichen die Untersuchung alternativer, nervensystemunabhängiger Regenerationswege. Ein solches Beispiel ist eine apikale Neurogenese und Kopfbildung, von der gezeigt wurde, dass sie sich auf die cnox-2- Funktion im Nervensystem in Wildtyp- Hydra auswirkt , scheint aber in nervenfreier Hydra entbehrlich zu sein, was darauf hindeutet, dass es einen alternativen Kopfregenerationsprozess geben kann 10 Nervenfreie Hydra wurden auch verwendet, um Epithelzell-Expression und Regulation von neurogenen und Neurotransmission-Genen nach dem Verlust der Neurogenese zu untersuchen 11 . Nervenfreie Hydra zeigen keine spontanen Kontraktionsbursts 12 , was darauf hinweist, dass diese Bursts durch das Nervensystem reguliert werden. Nervenfreie Hydra dagegen verhalten sich als Reaktion auf das Einklemmen der Körpersäule mit Pinzette, was darauf hindeutet, dass die Kontraktion in Reaktion auf mechanische Reize durch Kopplung von Throu vermittelt wirdGh-Spaltübergänge in Epithelzellen, während das spontane kontraktile Verhalten durch Kopplung durch Spaltübergänge in Nervenzellen vermittelt wird 13 . Nervenfreie Hydra öffnen ihre Münder nicht, wenn sie mit Nahrung oder reduziertem Glutathion 3 versehen sind , was darauf hindeutet, dass sensorische Neuronen notwendig sind, um die Anwesenheit von Nahrung zu erkennen und den Mund zu öffnen, um sich zu öffnen. Darüber hinaus scheint das Nervennetz eine Rolle bei der Erfassung des osmotischen Drucks zu spielen, weil nervenfreie Tiere nicht in der Lage sind, ihren internen hydrostatischen Druck durch die Mundöffnung autonom zu regulieren, wodurch ihr charakteristisches ballonähnliches Aussehen 3 , 4 ( Abbildung 1B ) verursacht wird. Die Regulation des hydrostatischen Drucks in der nervenfreien Hydra durch häufige manuelle Deflation führte zu einem Verlust einer abnormen Morphologie in der Hypostomie und der Körpersäule. Die chronische Deflation führte jedoch zu einer Störung des WachstumsOngation, Knospen und Gewebeorganisation 8 . Obwohl nervenfreie Hydra nicht in der Lage sind, sich selbst zu ernähren und zu ewigen, ist es möglich, sie unbegrenzt im Labor zu pflegen, indem man jedes Tier manuell zwangsernährt und zerbricht. Bisherige Veröffentlichungen haben Methoden der Zwangsernährung und des rülpsenden nervenfreien Hydra beschrieben , wobei jedoch diese Protokolle die Verwendung von Mikropipettenspitzen beinhalten, die von Hand sorgfältig auf die entsprechende Größe gezogen werden müssen, sowie die Verwendung eines Mundstücks, das durch die Rohrleitung 14 mit der Pipette verbunden ist. Hier wird eine einfachere, sicherere und zeitgerekere Methode der Fütterung und des Rülpens beschrieben. Darüber hinaus untersuchten frühere Studien die Abwesenheit von Nervenzellen durch die Dissoziation von fixierten Tieren in einzelne Zellen und die Untersuchung der Zellmorphologie 3 , 4 , 15 . HDie Immunhistochemie mit einem monoklonalen Antikörper gegen den tyrosinierten Carboxylterminus von alpha-Tubulin wurde als komplementäre Methode zur Mazeration verwendet, um die Erschöpfung von Neuronen im Hypostom 13 , 16 zu überprüfen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Neuronen im Stiel auch mit diesem Antikörper 13 sichtbar gemacht werden können, aber diese Neuronen sowie die in der Körpersäule sind schwerer zu erkennen. Während die Immunhistochemie ausreicht, um die Abwesenheit von Nervenzellen im Hypostom zu bestätigen und keine Kompetenz auf die Zelltyp-Morphologie erfordert, kann sie nicht dazu verwendet werden, auf die Abwesenheit der interstitiellen Stammzellen und der anderen Derivate dieser Zellen zu prüfen. Dissoziations- und Zellmorphologie-Studien sind strenger und können eine quantitative Berücksichtigung der Anzahl der einzelnen Zelltypen, die nach jedem Stadium der Behandlung verbleiben, geben.

<table><tbody><tr><td>Colchicine</td><td>Acros Organics</td><td>227120010</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>BD</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>Brine Shrimp Eggs</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>N/A</td><td>Can be purchased locally</td></tr><tr><td>Brine Shrimp Hatchery Dish</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Celltreat</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 3/4&quot; Hypodermic Needle</td><td>Covidien</td><td>1188830340</td><td>A 27G needle may also be used</td></tr><tr><td>2 x Fine-tip Tweezers</td><td>Dumont</td><td>0109-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>EMD Millipore</td><td>557303</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate)</td><td>Enzo</td><td>ADI-SAB-100-J</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fisher</td><td>08-920A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tablets</td><td>MP Bio</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T9028</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Air Pump</td><td>Tetra</td><td>77846-00</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipette</td><td>VWR</td><td>53283-916</td><td>Length of the pipet does not matter</td></tr><tr><td>15 mL Tube</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>P320 Sandpaper</td><td>3M</td><td>IBGABBV00397</td><td>Can be purchased at local home improvement store</td></tr></tbody></table>

generation and long-term maintenance of nerve-free hydra

Die interstitielle Zelllinie von Hydra umfasst multipotenten Stammzellen und deren Derivate: Drüsenzellen, Nematocyten, Keimzellen und Nervenzellen. Die interstitiellen Zellen können durch zwei aufeinanderfolgende Behandlungen mit Colchicin, einem pflanzlichen Toxin eliminiert werden, das die Trennzellen tötet, wodurch das Potenzial für die Erneuerung der differenzierten Zellen, die aus den interstitiellen Stammzellen gewonnen werden, gelöscht wird. Dies ermöglicht die Erzeugung von Hydra , die keine Nervenzellen haben. Ein nervenfreier Polypen kann seinen Mund nicht öffnen, um den osmotischen Druck zu ernähren, zu bestrafen oder zu regulieren. Solche Tiere können jedoch überleben und auf unbestimmte Zeit im Labor kultiviert werden, wenn sie regelmäßig zwangsernährt und geplatzt werden. Der Mangel an Nervenzellen ermöglicht die Untersuchung der Rolle des Nervensystems bei der Regulierung des Tierverhaltens und der Regeneration. Bisher veröffentlichte Protokolle für nervenfreie Hydra- Instandhaltung beinhalten veraltete Techniken wie Mundpipettieren mit handgezogener Mikropipette tIps, um die Hydra zu füttern und zu reinigen. Hier wird ein verbessertes Protokoll zur Pflege von nervenfreier Hydra eingeführt. Feinspitzen werden verwendet, um den Mund zu öffnen und frisch getötete Artemia einzusetzen. Nach der Zwangsernährung wird die Körperhöhle des Tieres mit frischem Medium unter Verwendung einer Spritze und einer Injektionsnadel gespült, um unverdautes Material zu entfernen, das hier als &quot;burping&quot; bezeichnet wird. Diese neue Methode der Kraft-Fütterung und Aufstoßen von nervenfreien Hydra durch den Einsatz von Pinzetten und Spritzen beseitigt die Notwendigkeit für Mund-Pipettieren mit handgezogenen Mikropipettenspitzen. Damit ist der Prozess sicherer und deutlich zeitaufwändiger. Um sicherzustellen, dass die Nervenzellen im Hypostom eliminiert wurden, wird die Immunhistochemie unter Verwendung von Anti-Tyrosin-Tubulin durchgeführt.

Unmittelbar nach der ersten 8 h colchicine Behandlung überleben alle Hydra . Einige dieser Hydra werden nur noch Tentakelstummel verbleiben ( Abbildung 3 A ), während andere ihre Tentakeln vollständig verloren haben ( Abbildung 3 B ). In den folgenden 1 oder 2 Tagen werden die Tentakeln weiter schrumpfen, bis alle Hydra ihre Tentakeln verloren haben. Etwa 1 Woche na...

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Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Durch eine doppelte Behandlung mit Colchicin, einem pflanzlichen Toxin, das trennende Zellen tötet, kann nervenfreie Hydra vulgaris erzeugt werden. Diese Hydra können nicht selbst ernähren oder bestochen werden. Dieses Papier beschreibt eine verbesserte Methode zur Langzeitpflege von nervenfreien Hydra vulgaris im Labor.

Erzeugung und Langzeitpflege von Nervenfreiheit<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

generation-and-long-term-maintenance-of-nerve-free-hydra

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

12.5K Aufrufe.  UC San Diego.  Durch eine doppelte Behandlung mit Colchicin, einem pflanzlichen Toxin, das trennende Zellen tötet, kann nervenfreie Hydra vulgaris erzeugt werden. Diese Hydra können nicht selbst ernähren oder bestochen werden. Dieses Papier beschreibt eine verbesserte Methode zur Langzeitpflege von nervenfreien Hydra vulgaris im Labor. 

Serie: Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Neurowissenschaften

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Biotechnik

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and free-swimming medusae. As exemplified in established models such as Hydra and Nematostella, stem cells and/or proliferative cells contribute to the development and regeneration of cnidarian polyps. However, the underlying cellular mechanisms in most jellyfish, particularly at the medusa stage, are largely unclear, and, thus, developing a robust method for identifying specific cell types is critical. This paper describes a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. Cladonema medusae possess branched tentacles that continuously grow and maintain regenerative capacity throughout their adult stage, providing a unique platform with which to study the cellular mechanisms orchestrated by proliferating and/or stem-like cells. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) using a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, while pulse labeling with 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU), an S phase marker, enables the identification of proliferating cells. Combining both FISH and EdU labeling, we can detect actively proliferating stem-like cells on fixed animals, and this technique can be broadly applied to other animals, including non-model jellyfish species.

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Here, we describe a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the jellyfish Cladonema. Whole-mount fluorescent in situ hybridization with a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, and 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine labeling enables the identification of proliferating cells. Together, actively proliferating stem-like cells can be detected.&#160;

Fluoreszierende In situ Hybridisierung und 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Markierung für stammähnliche Zellen in der Hydrozoenqualle Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Anatomisch inspirierte dreidimensionale Mikro-Gewebe-konstruierte Neuronale Netze für Nervensystem-Rekonstruktion, Modulation und Modellierung

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Neuronale Schaltungen neu verdrahten: Eine neue Methode zur schnellen Neuritenverlängerung und funktionellen neuronalen Verbindung

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

Generation von Neurosphären aus gemischten primären Hippocampus und kortikalen Neuronen isoliert aus E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Erzeugung transgener<em&gt; Hydra</em&gt; Durch Mikroinjektion Embryo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Biologie

<meta charset="utf8"></head><body>Effiziente Nukleofektion von NSCs, die aus der subventrikulären Zone der Maus isoliert wurden

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Verbesserte Nukleofektion für einen hocheffizienten Gentransfer in murinen subventrikulären Zonen abgeleiteten neuralen Stammzellkulturen

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

Erzeugung und Langzeitpflege von Nervenfreiheit

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Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone