Name: isolation and ex vivo culture of vδ1+cd4+γδ t cells, an extrathymic αβt-cell progenitor
Uploaded: 2015-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Ex Vivo Culture of VÃŽÂ´1+CD4+ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells, an Extrathymic ÃŽÂ±ÃŽÂ²T-cell Progenitor at JoVE.com

Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

Ethik Statement: Alle Verfahren wurden nach der Deklaration von Helsinki durchgeführt und wurden von der Klinischen Ethikkommission der Universität Tübingen genehmigt (Projekte 38 / 2009B02 und 470 / 2013B02). 1. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) <ol><li> Nehmen Sie 50-100 ml von einem gesunden Freiwilligen über Venenpunktion unter Verwendung einer 50 ml Spritze mit 1.000 IE Heparinsulfat und verdünnt das Blut 1: 2 mit PBS (pH = 7,2). </li><li> Sorgfältig Schicht 35 ml Blut: PBS-Lösung auf 15 ml Bluttrennlösung wie Biocoll (d = 1,077 g / ml) in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren für 15 min bei 800 × g bei RT. HINWEIS: Brems dürfen nicht verwendet werden. </li><li> Sammeln der Zellen des lymphatischen Schicht mit einer Pipette und die Zellen werden zweimal in mindestens 50 ml PBS (Zentrifuge für 12 min; bei 400 xg). Entfernen Sie den Überstand nach der Zentrifugation mit einer Pipette. </li><li> Lyse verbleibenden Erythrozyten durch die Aussetzung und Incubtriebs lymphozytären Fraktion mit 1-5 ml eines hypotonischen Pufferlösung für 2-4 min. Hinweis: Dauer der Exposition und Volumen Lysepuffer hängen vom verwendeten Lysepuffer und auf die Menge der roten Blutzellen in der Lymphozytenfraktion gelassen. </li><li> Verdünnen der Zellen mit PBS (1,10) und zentrifugiert bei 250 g für 12 min und anschließend wieder zu suspendieren und wasche das Zellpellet einmal in 10 ml PBS bei 300 g für 12 min. </li><li> Resuspendieren der Lymphozyten in PBS und zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Zählkammer mit Trypanblau-Lösung. HINWEIS: In der Regel werden&gt; 1 x 10 8 Lymphozyten von 100 ml erhalten frisch gezapftes peripheren Blut. </li></ol> 2. Isolierung von T-Zellen Vδ1 <ol><li> Take &lt;1 x 10 6 isolierten Lymphozyten für zunächst FACS Bestimmung der Frequenz Vδ1 CD4-T-Zellen. HINWEIS: Populationsgröße dieser T-Zell-Unternehmen kann stark zwischen den Individuen und nach ihrem Immunstatus abweichen. TypicVerbündeter, etwa 1% der T-Zellen sind Vδ1 + und etwa 1-5% der Vδ1 + Zellen sind CD4 +. <ol><li> Verdünnen der Zellen mit 1 ml FACS-Puffer, der PBS, enthaltend 2% FCS und 5 mM EDTA besteht. Zentrifuge bei 660 xg für 2 Minuten und Dekantieren des Überstandes. Das Rücklaufvolumen von etwa 100 ul FACS-Puffer ausreichend ist für die anschließende Färbung. Vortexen und Inkubation der Zellen mit 5 &amp; mgr; Fc-Blocking-Reagenz für 5 min bei RT für erhöhte Spezifität des FACS-Färbung. </li><li> Hinzufügen menschliche monoklonale Antikörper direkt an die Zellen, ohne den Fc-Blocking-Reagenz. Stellen Sie sicher, um die Zellen mit Antikörpern gegen Vδ1 (1:50), CD 3 (1:50), CD4 (1: 200) zu färben, CD8 (1: 200) und TCRαβ (01.25). Bereiten Sie die Isotyp-Kontrolle mit den entsprechenden Immunglobulin-Isotypen. Inkubieren Zellen mit Antikörpern für 20 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Zellen in 1 ml FACS-Puffer (Zentrifuge für 2 Minuten; bei 660 xg), dekantiert die supernatant und FACS Akquisition gehen in der verbleibenden Puffervolumen. </li></ol></li><li> Pelletisieren der Zellen durch Zentrifugation für 12 min (die nicht in der FACS-Analyse verwendet werden); bei 300 g; 8 ° C. Entfernen Sie den Überstand und Zell pelletin 60 &amp; mgr; l MACS-Puffer pro 1 x 10 7 Zellen. In 20 &amp; mgr; Fc-Blocking-Reagenz pro 1 x 10 7 Zellen und Inkubation für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l FITC-konjugierten anti-human Vδ1 Antikörper pro 1 x 10 7 Zellen direkt in die Zellen. Inkubation für 12 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Die Zellen werden mit 14 ml MACS-Puffer (Zentrifuge für 12 min; bei 300 g; 8 ° C). Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren der Zellen in 80 &amp; mgr; l MACS-Puffer pro 1x10 7 Zellen. </li><li> Nehmen 1-2 x 10 5 Zellen und verdünnte sie in 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer für die Überprüfung der Markierung durch FACS-Analyse. Keine weiteren Zusätze sind für diesen Schritt benötigt wird. Stellen Sie sicher, dass es eine ausreiziente Differenz in der Helligkeit für Vδ1 - und Vδ1 + Zellen. Ist dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie die Schritte 2.3) und 2.4). </li><li> In 20 ul Anti-FITC-Mikrokügelchen pro 1 x 10 7 Zellen zu den übrigen Zellen, gut mischen und inkubieren für 15 Minuten im Dunkeln bei 4 ° C. Danach die Zellen werden unter Verwendung von mindestens 10 ml MACS Puffer (Zentrifuge für 12 min, bei 300 g; 8 ° C). </li><li> Während der Zentrifugation äquilibrieren die in einem Magneten mit 500 &amp; mgr; l MACS-Puffer platziert vorgekühltem Magnetspalte. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 500 &amp; mgr; l MACS-Puffer (für die Zellzahlen höher als 1 x 10 8, Scale-up dieses Volumen entsprechend), und die Zellen anzuwenden vorsichtig auf die Säule. Sammeln Sie die Durchfluss mit dem Vδ1 - Zellen. </li><li> Dreimal Waschen der Säule mit 500 ul MACS-Puffer zu sammeln und das Durchfluss erneut in derselben Röhre. Beachten Sie, dass der Vorratsbehälter leer ist, bevor Puffer auf die Säule sein. </li><li> Entfernen Sie die Spalte aus der Magnetvorrichtung und legen Sie sie in einen 15 ml konischen Röhrchen. Spülen schnell die Säule mit 1 ml MACS-Puffer durch festes Drücken des Kolbens in der Spalte. Eluat in einem Rohr. HINWEIS: Um eine Reinheit von&gt; 98% zu erhalten, ist es üblicherweise notwendig, wiederholen Sie die Schritte 2,7-2,9) mit einem zweiten Spalte. </li><li> Überprüfen Sie die Reinheit der Zellen mittels FACS-Analyse 18 mit dem gleichen Antikörper-Panel wie zuvor (siehe 2.1.2) und zählen Sie die Zellen. </li></ol> 3. Isolierung Vδ1CD4 + T-Zellen <ol><li> Resuspendieren 25 ul CD4-Perlen mit einem Vortex für&gt; 30 Sek. Waschen der Kügelchen (die minimale Menge, wie vom Hersteller dargestellt) in 1 ml MACS-Puffer in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß, indem das Röhrchen in einem Magnet für 1 min. Überstand verwerfen vorsichtig mit einer kleinen Pipette (200 ul) und Resuspendieren der Beads in dem ursprünglichen Volumen der MACS-Puffer. </li><li> Pelletieren Vδ1 + Zellen (Zentrifuge für 12 min; bei 300 g) und saugen Sie den Überstand und resuspendieren alle Vδ1 + Zellen in 500 &amp; mgr; l MACS-Puffer und fügen Sie sie in das Rohr, das die Perlen. Kräftig mischen und Inkubation für 20 min bei 4 ° C unter konstantem Neigungs (beispielsweise in einem Drehgelenk). </li><li> Das Röhrchen, das die Zellen in einem Magnet für 2 min. Stellen Sie sicher, dass es keine Reste im Deckel. HINWEIS: Die CD4 + -Zellen werden die magnetischen Perlen gebunden sind und heften sich an die Seite des Rohrs gegenüber dem Magneten. </li><li> Den Deckel vorsichtig öffnen, während der Schlauch in der Magneteinrichtung und sammeln Sie den Überstand, der die CD4 enthält - + Vδ1 Zellen unter Verwendung eines kleinen Pipetten. Platzieren CD4 - Vδ1 + Zellen in ein separates Röhrchen und setzen dieses Rohr in den Magneten wieder möglicherweise vermeiden verbleibenden CD4-Zellen oder Kügelchen, aus der Population. <ol><li> Waschen Sie die CD4 - Zellen in 5 ml MACS-Puffer (Zentrifuge für 12 min; bei 300 g) and resuspendieren sie in einer Konzentration von 1 x 10 5 Zellen pro 100 &amp; mgr; l Medium. CD4 - Zellen können leicht unter den unten (4.2) gegebenen Bedingungen kultiviert werden. </li></ol></li><li> Das Röhrchen mit den CD4-Zell Ziele außerhalb des magnetischen Feldes, resuspendieren Zellen in 500 &amp; mgr; l MACS-Puffer und setzen Sie diese wieder in die Magnetvorrichtung. Wiederholen Sie die Schritte 3,3-3,5 zweimal, um eine höhere Reinheit zu erhalten. Überstand entfernen durch Pipettieren </li><li> Resuspendieren der CD4 + -Zellen in 100 ul Kulturmedium (RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin) und füge 10 ul einer Wulst Ablöselösung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 45 min mit konstanter Kippen (beispielsweise in einem Drehgelenk). </li><li> Platzieren der Zellen in einem Magnet für 1 min. Sorgfältig sammeln Überstand, der Wulst freie Vδ1 + CD4 + Zellen unter Verwendung einer kleinen Pipette. </li><li> Außerhalb des Magneten, resuspendieren die Perlen mit 100 ul Kulturmedium, und wiederholen Siedie Schritte 3.6 und 3.7 zweimal höhere Zellzahlen von CD4 + Zellen zu erhalten. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen (bei 300 g zentrifugiert, für 12 min) und den Überstand verwerfen vollständig durch Pipettieren. Die Zellen in frischen, vorgewärmten Medien und zählen. Prüfung der Reinheit der Vδ1 + CD4 + Zellen durch FACS-Analyse in den Schritten 2.1.1-2.1.3 dargestellt. </li></ol> 4. Single-Zell-Klonen durch limitierte Verdünnung <ol><li> Isolieren peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus einem allogenen Spender, wie in 1,1-1,6 dargestellt. </li><li> Bestrahlen 2,5 x 10 7 allogenen PBMCs mit 80 Gy in 25 ml Kulturmedium mit γ-Strahlung. </li><li> Hinzufügen IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) und PHA (2 ug / ml) zu den bestrahlten Feeder-Zellen und verteilen sie in 96-Well U-förmigen Platten, 5 x 10 4 feeder Zellen in 50 ul pro Vertiefung. </li><li> Verdünnt den Vδ1 + CD4 + Zellen zu einer Konzentration von 0,3 Zellen pro 50 ul. Pipette 50 ul der Zelllösung zu jeder Vertiefung beherbergen die bestrahlten Zellen und Cytokinen. Hinweis: So werden die Cytokine bis zu einer Endkonzentration von 100 U / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 und 1 ug / ml PHA verdünnt. Die 96-Well-Platten in einem Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre. <ol><li> Wahlweise kultivieren bleibt als Massenkultur unter den gleichen Kulturbedingungen wie die Klone gereinigt Vδ1 + CD4 + -Zellen. </li></ol></li><li> Liefern die Zellen alle 3-4 Tage mit Zytokinen und frische Medien. Hierzu Austausch Hälfte des Mediums in den Vertiefungen mit 50 &amp; mgr; l frisches Medium durch Pipettieren. In 2-fache Konzentration der Zytokine auf jede Ergänzung. In 5x10 4 bestrahlten Feeder-Zellen pro Vertiefung jeder anderen Runde der Fütterung. </li><li> Mit einem Mikroskop beobachten ersten Klone sichtbar nach 3-4 Wochen zu werden, wie sie verstoffwechseln und so ändern die Farbe des Kulturmediums und Kolonien bilden. HINWEIS: Pelzther Anbau, resuspendieren Klone gut und sie auf 96-Well-Platten zu trennen. Analysieren Sie die Zellen über FACS wie in 2.1.1-2.1.3 angezeigt. Klone unter diesen Bedingungen gehalten, kann schließlich ihren TCR von Vδ1 verändern αβTCR. Der Zeitpunkt für diese Transdifferenzierung ist von Klon zu Klon. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Um den Phänotyp, der Biologie und Funktion einer knappen (T-) Zell Einheit zu studieren, nämlich Vδ1 + CD4 + T-Zellen, verwendeten wir zwei Marker: Vδ1 und CD4 für seine positive magnetische Zellisolierung. Vδ1 ist ein Orphan-Rezeptor, während CD4 auf T-Helfer-Zellen exprimiert wird, auf einem niedrigeren Niveau auf Monozyten und dendritischen Zellen, und auf einem sehr niedrigen Niveau von hämatopoetischen Vorläuferzellen. Techniken zur Anreicherung und Selektion von Zel...

Bei Wirbeltieren spielt adaptiven Immunität, die in der zellulären und humoralen Immunität Teil strukturiert ist, eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern. Die Erkennung von einer Vielzahl von Antigenen durch hyperpolymorphic T- und B-Zell-Rezeptoren (TCR / BCR), der in Bezug auf T-Zellen wird angenommen, dass vor allem im Thymus 1 produziert werden, vermittelt. Daran, hämatopoetische Stammzellen (HSC), aus dem Knochenmark, Samen der Thymus und Differenzierung entlang gut definierte Stadien schließlich, die zu allen T-Zell-Linien. Thymus Impfen Vorläuferzellen sind CD4 - und CD8 - und damit stellen die unreifen, doppelt negative (DN) Thymozyten Fraktion. Thymus-abgeleiteten Signale dann zu induzieren ihre Abstammung Engagement und die Differenzierung entweder in αβ bzw. γδ T-Zellen. Die Expression von funktionell neu arrangierte TCR-γ und δ TCR-Kettengene in DN2 / 3 Thymozyten zu δTCR Komplexe, die Zellproliferation eine Fahrt ggr;d Förderung der Differenzierung in γ &amp; dgr; T-Zellen 2,3. Im Gegensatz dazu ist die Umlagerung einer funktionellen TCR-β-Kette, die mit preTα koppeln kann, um eine preTCR pT aufzubauen, induziert die transkriptionalen Silencing des TCR-γ-Kette in DN3 Thymozyten und deren Übergang in CD4 + CD8 + doppelt positiven Thymozyten 4 . In diesem Stadium Rekombination des TCR-α-Kette auftritt, das Löschen der TCR-δ-Locus, die im TCR-α-Locus eingebettet, wodurch eine Aufhebung der Produktions γδTCR in diesen Zellen unwiderruflich 5-9. Umgeordnet αβTCRs werden anschließend auf ihre Fähigkeit zur Selbst MHC schwach binden (positive Selektion), die einen bestimmten Schwellenwert nicht übersteigen darf, um Autoimmunerkrankungen (negative Selektion) vermeiden ausgewählt. Entsprechend ihren Möglichkeiten zu binden MHC-Klasse I oder II, entwickeln die ausgewählten αβT Zellen in Einzel positive CD4 + oder CD8 + T-Zellen, die Ausfahrt der Thymus als naive T-Zellen. , Rückbildung des Thymus beginnt jedoch schon früh im Leben, die zu exponentiell verringert Leistung von naiven T-Zellen, die fast erloschene Postadoleszenz 10 ist. Dennoch bleibt die Größe der T-Zell-Pools während des gesamten Lebens, die nur teilweise durch post-Thymus homöostatische Proliferation von T-Zellen und der Proliferation der langlebig immunologischen Gedächtnisses 11 erklärt werden kann, konstant. Folglich muss extrathymic T-Zell-Entwicklung auftritt. Die neuere Forschung hat erhebliche Anziehungskraft, die αβT Vorläuferzellen, die bei extrathymic-sites-verursachte Funktions αβ T-Zellen 12-17 gekennzeichnet gewonnen. Dennoch ist detailliertes Wissen über extrathymic αβT Vorläuferzellen, die aus einem Thymus-unabhängige differenzieren sich in αβT Zellen als fragmentarisch wie der Hintergrund, dass wir auf dem Weg, den sie so zu nehmen. Vor kurzem haben wir das kleine T-Zellen-Einheit der Vδ1 + identifiziert </sup&gt; CD4 + Zellen γδT als extrathymic αβT Zell prognitor 18, die, wenn sie aus dem peripheren Blut von gesunden menschlichen Spendern isoliert in einem milden entzündlichen Umgebung in αβT Zellen transdifferen. Interessanter und entgegen der homöostatischen Proliferation von post-Thymus-T-Zellen, Transdifferenzierung Vδ1 CD4 + Zellen generiert neue T-Zell-Rezeptoren, wodurch die Erweiterung des Repertoires Diversität, so dass potentiell neuer Antigene erkannt werden, und kann den Schutz des Wirtes gegen neu erworbenen Erregern. Dies trägt zur Plastizität von T-Zellen und fügt eine bisher unbeachtet neuen Weg für extrathymic T-Zell-Entwicklung. Die quantitative Isolierung von lymphatischer Quellen, die Erzeugung von Einzelzellklonen und deren effiziente Expansion sind wesentlich für das Ziel, jene Marker und Moleküle, die diese auslösen αβT Zell precursor`s extrathymic Entwicklung zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>Biocoll Solution</td><td>Biochrom</td><td>L 6113</td><td>lymphocyte separating solution</td></tr><tr><td>Lysing Buffer</td><td>BD BioSciences</td><td>555899</td><td>lysis of erythrocytes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>supplement with BSA and pre-cool before use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human Vd1 FITC (clone:&amp;nbsp; TS8.2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TCR2730</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td><td>BD BioSciences</td><td>345766</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td><td>BD BioSciences</td><td>555548</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-333</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td><td>BD BioSciences</td><td>641400</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>Anti-FITC MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-058-701</td><td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>pre-cool before use</td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Positive Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>11331D</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

Thymus, das wichtigste Organ für die Erzeugung von αβ-T-Zellen und das Rückgrat des adaptiven Immunsystems bei Wirbeltieren, ist seit langem als die einzige Quelle von αβT Zellen berücksichtigt. Dennoch beginnt Thymusinvolution im Leben, die zu einer drastisch reduzierten Leistung von naiven αβT Zellen in die Peripherie zu früh. Dennoch können sogar Hundertjährigen Immunität gegen neu erworbenen Erreger aufzubauen. Jüngste Untersuchungen legen nahe extrathymic αβT Zellentwicklung, aber unser Verständnis der Signalwege, die für Thymus-Funktionsverlust kompensieren kann immer noch rudimentär. γδ T-Zellen sind angeboren Lymphozyten, die den Haupt T-Zell-Untergruppe in den Geweben dar. Wir haben vor kurzem eine bisher unbeachtet herausragende Funktion zu einem γδ T-Zell-Untergruppe zugeschrieben durch die zeigen, dass die knappe Einheit von CD4 + Vδ1 + γδ T-Zellen können in αβT Zellen in entzündlichen Erkrankungen transdifferen. Hier haben wir provide das Protokoll für die Isolierung dieser Progenitorzellen aus dem peripheren Blut und die anschließende Kultivierung. Vδ1 Zellen positiv von PBMCs von gesunden menschlichen Spendern unter Verwendung von magnetischen Kügelchen angereichert, gefolgt von einem zweiten Schritt, bei dem man gezielt die knappen Fraktion von CD4 + Zellen mit einem weiteren magnetischen Markierungstechnik. Die Magnetkraft der zweiten Kennzeichnung der als einer der ersten magnetischen Etiketten überschreitet, und ermöglicht die effiziente, quantitative und spezifische positive Isolation der Population von Interesse so. Danach führen die Technik und die Kulturbedingungen für die Klonierung und effizient Expansion der Zellen und zur Identifizierung der erzeugten Klone mittels FACS-Analyse erforderlich. Somit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Reinigung, die Kultur und ex vivo Expansion von CD4 + Vδ1 + γδ T-Zellen. Dieses Wissen ist Voraussetzung für Studien, die zu dieser αβT Zell progenitor`s Biologie beziehen, und für diejenigen, die ide Zielntify die molekularen Auslöser, die in ihrer Transdifferenzierung beteiligt sind.

Figur 1 zeigt die verschiedenen Schritte und das Ergebnis der Trennung der Vδ1 T-Zellen aus dem peripheren Blut. 1A zeigt eine typische Verteilung der Vδ1 + Zellen CD3 + Lymphozyten, sowie die Co-Rezeptor die Expression des Vδ1 + -Population. In diesem Spender, ist die Frequenz der Vδ1 + Zellen (rot) 2,3% des Gesamtlymphozytenzahl und der CD4-Expression (grün) der Vδ1 + Lymphozyten beträgt 2,6%. Insgesamt ist die Zielgruppe f...

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Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolation und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur des Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-Zellen, eine extrathymic αβT-Zell-Vorläufer

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.2K Aufrufe.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Serie: Isolation and Ex Vivo Culture of Vδ1+CD4+γδ T Cells, an Extrathymic αβT-cell Progenitor

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Immunologie und Infektion

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major histocompatibility complex (MHC)-independent manner and develop strong cytolytic effector function that makes it an ideal candidate for cancer immunotherapy. Due to the low frequency of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cells in the peripheral blood, we developed an effective protocol to greatly expand a highly pure &#947;&#948; T cells drug product for first-in-human use of allogeneic &#947;&#948; T cells in patients with acute myeloid leukemia (AML). Using healthy donor apheresis as an allogenic cell source, the lymphocytes are isolated using a validated device for a counterflow centrifugation method of separating cells by size and density. 
The lymphocyte-rich fraction is utilized, and the &#947;&#948; T cells are preferentially activated with zoledronic acid (FDA-approved) and interleukin (IL)-2 for 7 days. Following the preferential expansion of &#947;&#948; T cells, a clinical-grade magnetic cell-separation device and TCR&#945;&#946; beads are used to deplete contaminating T-cell receptor (TCR)&#945;&#946; T cells. The highly enriched &#947;&#948; T cells then undergo a second expansion using engineered artificial antigen-presenting cells (aAPCs) derived from K562 cells-genetically engineered to express single-chain variable fragment (scFv) for CD3 and CD28, 41BBL (CD137L) and IL15-RA-together with zoledronic acid and IL-2. Seeding all day-7 enriched &#947;&#948; T cells in co-culture with the aAPCs facilitates the manufacture of highly pure &#947;&#948; T cells with an average fold expansion of &gt;229,000-fold from healthy donor blood.

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta &#947;&#948; T Cells from Apheresed Human Product

Presented is a protocol for the expansion of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cell drug product. Lymphocytes are isolated by elutriation and &#947;&#948;-enriched with zoledronic acid and interleukin-2. Alpha-beta T cells are depleted using a clinical-grade magnetic separation device. The &#947;&#948; cells are co-cultured with K562-derived, artificial antigen-presenting cells and expanded.

Erweiterung und Anreicherung von Gamma-Delta (γδ) T-Zellen aus Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Krebsforschung

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Untersuchung der Aortenklappenverkalkung durch Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten unter Verwendung von Feederzellen aus bestrahltem Buffy-Fell

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

<meta charset="utf8"></head><body>Hochauflösendes bildgebendes Verfahren zum Nachweis von Ca2+ -Mikrodomänen in T-Zellen

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der anfänglichen Aktivierung der adaptiven Immunantwort für therapeutische Interventionen

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Bildgebung von anfänglichen Ca2+ -Mikrodomänen in primären T-Zellen

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

Isolation und

Zusammenfassung

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Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Erweiterung und Anreicherung von Gamma-Delta (γδ) T-Zellen aus Apheresed Human Product

Maus Naive CD4

Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs

Untersuchung der Aortenklappenverkalkung durch Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten unter Verwendung von Feederzellen aus bestrahltem Buffy-Fell

Bildgebung von anfänglichen Ca²⁺ -Mikrodomänen in primären T-Zellen

Bildgebung von anfänglichen Ca²⁺ -Mikrodomänen in primären T-Zellen

Bildgebung von anfänglichen Ca²⁺ -Mikrodomänen in primären T-Zellen