Name: streamlined single cell tcr isolation and generation of retroviral vectors for in vitro and in vivo expression of human tcrs
Uploaded: 2017-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs at JoVE.com

Diese Studie wurde von JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30-DK079638-05-PILOT PJ, and The Robert und Janice McNair Foundation finanziert.
Wir danken Sandra Pena und Andrene McDonald für Rekrutierung von Patienten, Samuel Blum für technische Hilfe, Dr. George Makedonas für die Gabe von Antikörpern und Kontrolle DNA für die PCR Optimierung verwendet.

1. Identifizierung der T-Zell-Population von Interesse.
 Hinweis: Antigen spezifischen Verbreitung in Kombination mit Zellteilung Farbstoff (z. B. Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester, CFSE-) verwendet werden, kann um T-Zellen zu isolieren basierend auf ihre Verbreitung in Reaktion auf Antigene Stimulation. Wenn von PBMCs beginnen, eine 7-Tage in Vitro Expansion sollte ausreichen, um ein Antigen spezifische CFSE-geringe Bevölkerungsdichte 12 identifizieren.
<ol><li>Mix PBMCs 1:1 mit MHC abgestimmt Feeder-Zellen und Aufkleber mit 5 µM CFSE-Zellteilung Farbstoff.</li>
	<li>Platte 2-2,5 x 10 5 Zellen pro Bohrloch in einer 96-Well Rundboden Kultur Platte in 200 µL 10 % FCS komplette RPMI Medien. 
	Hinweis: Enthält komplette RPMI, 2 mM l-Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat, 100 µM MEM nichtessentiellen Aminosäuren, 5 mM HEPES, 5,5 × 10 &#8722; 5 Einheiten von 2-Mercaptoethanol, 100 mL U &#8722; 1 Penicillin und 100 µg mL &#8722; 1 Streptomycin.</li>
	<li>Stimulieren Zellen mit 25 µM-Peptid-Antigen.</li>
	<li>Am vierten Tag der Kultur sorgfältig entfernen und ersetzen Sie 100 µL Medien. 
	Hinweis: Ein optimaler Ansatz für Antigen-spezifische T-Zell-Erkennung ist die Verwendung von Peptid-HLA Tetramers 13. Tetramer Färbung ermöglicht eine gleichzeitige Beurteilung der Antigen-Spezifität sowie HLA-Beschränkung.</li>
</ol> 2. Richten Sie die einzelne Zelle Art.
<ol><li>Perform kostenlos alle Verfahren in eine Kapuze oder einen bestimmten Bereich verstärkte Vorlage. Aliquoten Reagenzien zur Vermeidung von Kontaminationen, reinigen alle Arbeitsflächen und wenn möglich, Geräte mit 10 % Bleichmittel vor PCR Setup. Verwenden Sie Filter-Tips, RNAse und DNAse frei Reagenzien und Kunststoffe in der PCR und Vektor klonen Schritte. Wichtige Reagenzien finden Sie in der Tabelle der Materialien. 
	Hinweis: Die Multiplex-PCR-Reaktion ist sehr empfindlich, und geringe Mengen an Verunreinigungen verstärkten Produkt führen können.</li>
	<li>Generieren der reversen Transkription-master-Mix durch die Kombination 10 x Funktelegrafie-Reaktion-Puffer, 25 X DNTPs, 9 U RT Enzym, 0,01 % Triton-X, 0,7 U RNAse-Inhibitor und 383 nM jeden RT TCR Grundierung (siehe Tabelle 1) in einem sterilen Pipettieren Reservoir. Machen Sie für jede 96-Well-Platte genügend master-Mix für 10 zusätzliche Reaktionen (insgesamt 106), zum Ausgleich von Flüssigkeitsverlust beim Pipettieren. Siehe Tabelle 2 für Reaktionskomponenten und Mengen pro Bohrloch.</li>
	<li>Vorbereitung einer 96-Well-PCR-Sammlung Platte für Zelle Sortierung nach 6 µL der reversen Transkription-master-Mix pro Bohrloch mit einer Mehrkanal-Pipette pipettieren. Halten Sie die Platte auf Eis oder in einem kalten Block.</li>
	<li>Zellen mit Antikörpern gegen Oberflächenmarker (wie CD3, und CD4 oder CD8 und CD3, jeweils 2 µg/mL, in Kombination mit Zellteilung Farbstoff oder Tetramer Färbung) Zelle beschriften.</li>
	<li>Art T-Zellen in einer Zelle pro Bohrloch, überspringen der zwölften Reihe, die als Negativkontrolle dienen wird. 
	Hinweis: Die Effizienz der Art präzise Erfassung Platte Ausrichtung innerhalb der Kennzeichenhalter, sowie die Aufrechterhaltung der Zellen und die Platten bei niedriger Temperatur vor der cDNA Reaktion abhängig. Sammlung Platten sollte auf dem Eis zu allen Zeiten, außer gehalten werden beim Sortieren, wenn sie innerhalb der Kühlplatte behoben werden. Nicht alle Sortiermaschinen verfügen über eine Temperatur geregelte Kennzeichenhalter; Allerdings ist die Verwendung eines dringend empfohlen. Da die Art in der Regel ca. 10-15 min pro Platte dauert, gibt es ein erhöhtes Potenzial für RNA-Abbau, wenn die Platte nicht bei einer niedrigen Temperatur beibehalten wird.</li>
	<li>Als Positivkontrolle, eine größere Anzahl von Zellen (100) manuell hinzufügen mit einer Pipette zu einem der Brunnen in diesem Stadium. Alternativ zuvor isolierten RNA aus gepoolten Zellen kann verwendet werden als Positivkontrolle bei 10 ng pro Bohrloch. 
	Hinweis: Pipette gereinigten Kontrolle RNA mit Präzision und Pflege zur Vermeidung von Kreuzkontamination anderer Brunnen und falsch-positive Ergebnisse.</li>
	<li>Dichtplatte mit Klebefolie und spin-down bei 1000 X g für 5 min bei 4 ° c</li>
	<li>Sofort zu transkribieren RNA in cDNA durch Inkubation der Platte bei 25 ° C für 10 min, 37 ° C für 45 min und 85 ° C für 10 min. 
	Hinweis: Um effiziente PCR-Reaktion zu gewährleisten, wird empfohlen, dass die erste PCR-Reaktion am selben Tag durchgeführt werden. Alternativ können die transkribierten Platten im-80 ° C bis zu 2 Monate gehalten werden.</li>
</ol> 3. Multiplex-nested PCR durchführen Hinweis: bereiten Sie alle Meister Mixe in eine saubere Vorlage-freien Zone zur Vermeidung von Kontaminationen.
<ol><li>Stellen jede Variable Region Grundierung bis 100 µM mit DNAse und RNAse frei H 2 O. Als nächstes kombinieren Sie 20 µL jedes der 44 Primer, den V-Alpha-Grundierung-Pool zu generieren. Um die V-Beta zu generieren Grundierung Pool kombinieren 20 µL jeder der 40 V-Beta-Primer plus 80 µL DNAse und RNAse frei H 2 O. Primer Sequenzen in Tabelle 1 aufgeführt sind. Sobald gebündelt, die Konzentration des jedes Primers in der Mischung ist 2,3 µM.</li>
	<li>Rekonstruieren die konstante Region Primer zu 100 µM-Stammlösung mit DNAse und RNAse frei H 2 O. verdünnt die konstante Region Primer 10 µM Arbeitslösung und aliquoten einsetzbar.</li>
	<li>Zwei separate master Mischungen vorbereiten TCR-Alpha und TCR-Beta-Verstärkung. Die master-Mixes zu erzeugen, durch die Kombination von 5 X buffer, 80 µM dNTPs, 3 % DMSO, 2 µM Grundierung Pool (Endkonzentration von 46 nM für jede Grundierung), 200 nM TCR-konstante Region rückwärts-Primer, 1 U DNA-Polymerase und DNAse und RNAse frei H 2 O (Tabelle 2 < / starke >). Für jede 96-Well-Platte machen genügend master-Mix für 10 zusätzliche Reaktionen (insgesamt 106), Ausgleich für den Verlust von Flüssigkeit beim Pipettieren. 
	Hinweis: Die Berechnungen basieren auf der PCR Endvolumen von 25 µL pro Bohrloch, wo 22,5 µL master PCR-Mix mit 2,5 µL cDNA-Vorlage kombiniert wird.</li>
	<li>Halten die Platte mit cDNA auf Eis oder in einem kalten Block. Mithilfe einer Mehrkanal TCR-Beta-Reaktion in eine neue 96-Well-PCR-Platte 22,5 µL pipette. Verwenden Sie dann ein Multichannel 2,5 µL cDNA in die PCR-Platte übertragen.</li>
	<li>Verwenden, eine Mehrkanal um 22,5 µL der TCR-Alpha Reaktion direkt in die Platte mit dem Rest der cDNA pipette.</li>
	<li>Dichtung die Platten mit Klebstoff, sanft Wirbel und Spin nach unten bei 1000 X g für 5 min bei 4 ° c</li>
	<li>Die Multiplex-PCR-Reaktion mit den folgenden Zyklen laufen: 5 min bei 95 ° C gefolgt von 34 Zyklen von 20 s bei 95 ° C, 30 s bei 54 ° C und 1 min bei 72 ° C, gefolgt von 7 min bei 72 ° c</li>
	<li>Tragen, die verschachtelten PCR-Reaktion in einem Endvolumen von 25 µL, 2,5 µL der Multiplex-PCR Mischung als Vorlage verwenden.
	<ol><li>Rekonstruieren die internen und Adapter Primer bis 100 µM mit DNAse und RNAse frei H 2 O. machen 10 µM Aliquote für den arbeitenden bestand.</li>
		<li>Zwei separate master Mischungen vorbereiten TCR-Alpha und TCR-Beta amplifizierung. Mix 5 X Puffer, 25 X DNTP, 3 % DMSO, 200 nM vorwärts Adapter Grundierung, 200 nM rückwärts verschachtelte-Primer, 1 U DNA-Polymerase und DNA-Polymerase und Nuklease-freie H 2 O für ein Endvolumen von 22,5 µL (Tabelle 2). Für jede 96-Well-Platte machen genügend master-Mix für 10 zusätzliche Reaktionen (insgesamt 106), zum Ausgleich von Flüssigkeitsverlust beim Pipettieren. 
		Hinweis: Bei der zweiten PCR Reaktion Verwendung der 5 X PCR Puffer mit Beladung Farbstoff Agarosegel beladen zu erleichtern.</li>
		<li>Mit einer Mehrkanal pipette die master Mischungen für die TCR-Alpha und TCR-Beta-Reaktionen auf 22,5 µL pro Bohrloch in zwei neue 96-Well-PCR-Platten.</li>
		<li>Fügen Sie die Multiplex-PCR-Reaktion-Vorlage am 2,5 µL pro Bohrloch. 
		Hinweis: Die verbleibenden erste PCR Reaktion sollten versiegelt und bei-20 ° C dienen als Quelle für zusätzliche Vorlage gespeichert, falls es nötig (siehe Schritt 4.3 Hinweis).</li>
		<li>Dichtung der Platten, sanft Wirbel und Spin down 1000 X g für 5 min bei 4 ° c</li>
		<li>Die verschachtelte PCR-Reaktion mit den folgenden Zyklen laufen: 5 min bei 95 ° C gefolgt von 34 Zyklen von 20 s bei 95 ° C, 30 s bei 56 ° C und 1 min bei 72 ° C, gefolgt von 7 min bei 72 ° c</li>
		<li>Laufen 5 µL der letzten Reaktion, auf eine 1 % Agarose-gel mit Interkalation Bromid (einschließlich der negativen und positiven Kontroll-Vertiefungen). 
		Hinweis: Die erwartete Band sollte bei rund 500 bp Größe ausgeführt. Eine Beispiel-Reaktion ist in Abbildung 2 gezeigt.</li>
		<li>Reinigen den Rest der zweiten Reaktion (20 µL) mit einem 96-Well-Format PCR Reinigung Kit, Eluieren mit 15 µL von 70 ° C H 2 O pro Bohrloch, und führen Sie Sanger Sequenzierung. Verwenden Sie die entsprechende TCR-Alpha oder TCR-Beta-Adapter vorwärts Primer für die Sequenzierung (Tabelle 1). 
		Hinweis: Sequenzen mit online verfügbaren Immungenetik Software analysiert werden können.</li>
	</ol></li></ol> 4. Alpha- und Beta-PCR-Ketten vor-Klonen.
 Hinweis: der Pool die forward Primer verwendet in der ersten Reaktion und die reverse Primer in der zweiten PCR-Reaktion werden verwendet, um Restriktionsschnittstellen zu integrieren. Daher die erhaltenen Alpha- und Beta-Kette PCR-Produkte sind bereit, sequenziell Sub geklonten in der Vorlage retroviral Vektor ( Abbildung 1).
<ol><li>Digest der gereinigten PCR-Produkte aus der Beta verschachtelt Reaktion mit BstbI und MfeI (Tabelle 3). 
	Hinweis: Nicht mehr als 5 µg einfügen.</li>
	<li>Parallel zu verdauen die Vorlage Vektor mit BstbI und MfeI (Tabelle 3). Verwenden Sie 1-2 µg des Vektors Vorlage pro TCR. Führen des verdauten Vektors auf einem Agarosegel, und die größeren Band (~ 7500 bp) zu isolieren. Reinigen den Vektor mit einem DNA-Reinigung-Kit-Gel. 
	Hinweis: Während das Restriktionsenzym verdauen, die Vorlage murine TCR-Beta-Variable Region entfernt, ermöglicht die Zugabe der menschlichen TCR-Beta-Variable Region.</li>
	<li>Reinigen die verdaute PCR-Produkte mit einem PCR Reinigung Kit. 
	Hinweis: Vergewissern Sie sich die DNA Reinigungskapazität der im Kit enthaltenen Spalten; Verwenden Sie mehrere Spalten, wenn nötig. Der Mindestbetrag für einen gereinigten Einsatz notwendig für eine erfolgreiche Unterbindung Reaktion ist 50 ng auf eine minimale Konzentration von 10 ng/µL. Wenn die gereinigte Insert-Menge für eine erfolgreiche Verbindung nicht ausreicht, kann die zweite PCR Reaktion wiederholt werden.</li>
	<li>Behandlung den Vorlage Vektor mit 10 U CIP-Enzym für 1 h bei 37 ° C zu verhindern selbst Ligation, gefolgt von Hitzeinaktivierung für 10 min bei 75 ° c zu reinigen die DNA mit einem PCR-Reinigung-Kit (Tabelle 3).</li>
	<li>Ligate TCR-Beta einfügen und Vektor-DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 20 µL bei 6 Molaren Überschuss des Einsatzes für 30 min bei Raumtemperatur mit. 
	Hinweis: Insgesamt die Ligatur Reaktion sollte enthalten ca. 150 ng DNA (Tabelle 3).</li>
	<li>Für Transformationen, mix 8 µL der Ligatur Reaktion mit 80 µL chemisch kompetenten e. coli DH5α Zellen (Table of Materials) und inkubieren Sie für 30 min. Hitzeschock bei 42 ° C für 45 S. hinzufügen 500 µL auf Eis Super Optimale Brühe mit Catabolite Unterdrückung (S.O.C.) Medium und schütteln für 1,5 h bei 37 ° c</li>
	<li>Platte, 250 µL Bakterienkultur auf einem Ampicillin, Lysogeny Brühe (LB) Nährbodenplatte enthält. Inkubieren Sie die Platte über Nacht (~ 16 h) bei 37 ° c</li>
	<li>Am nächsten Tag abholen Bakterienkolonien und wachsen sie in 3 mL LB-Medium mit Ampicillin über Nacht. Isolieren die Plasmid-DNA mit DNA Plasmid Reinigung Kit.</li>
	<li>Bestätigen die erfolgreiche Aufnahme der Beta-Kette durch einen kleinen Test-Digest mit Restriktionsenzymen BstbI und MfeI. Kombinieren Sie in einem 12 µL Gesamt Reaktionsvolumen 200-500 µg Plasmid DNA, 0,25 µL jedes Enzym und 10 X Enzym Puffer (Tabelle 3). Führen Sie die Reaktion heraus auf einem 1 % Agarosegel mit Interkalation Bromid um die Größe der Band einfügen zu bestätigen (~ 500 bp).</li>
	<li>Nach der Bestätigung der Anwesenheit des Einsatzes, Reihenfolge den TCR-Beta-Abschnitt des Vektors mit dem IRES-rückwärts-Primer (Tabelle 1).</li>
	<li>Nach Reihenfolge Bestätigung des TCR-Beta-Einsatzes, ein ähnliches Verfahren zum Einfügen der alpha Variable Region durchführen. Die gereinigten PCR-Produkte von alpha verschachtelte Reaktion und die neu erzeugten TCR-Beta-Einlage mit Vektor, mit SnaBI und SacII verdauen. 
	Hinweis: Während das Restriktionsenzym verdauen, die Vorlage murine TCR-Alpha Variable Region entfernt, ermöglicht die Zugabe der menschlichen TCR-Alpha Variable Region.</li>
	<li>Ligate Alpha fügt in TCR Vektoren Codierung der entsprechenden Beta-Variable Region mit DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 20 µL bei 6 Molaren Überschuss des Einsatzes für 30 min bei Raumtemperatur. 
	Hinweis: Insgesamt die Ligatur Reaktion sollte enthalten ca. 150 ng DNA (Tabelle 3).</li>
	<li>Für Transformationen, mix 8 µL der Ligatur Reaktion mit 80 µL chemisch kompetenten e. coli DH5α Zellen (Table of Materials) und inkubieren Sie für 30 min. Hitzeschock bei 42 ° C für 45 S. hinzufügen 500 µL S.O.C. auf Eis Medium und schütteln für 1,5 h bei 37 ° c</li>
	<li>Platte, 250 µL Bakterienkultur auf einem Ampicillin, Lysogeny Brühe (LB) Nährbodenplatte enthält. Inkubieren Sie die Platte über Nacht (~ 16 h) bei 37 ° c</li>
	<li>Am nächsten Tag abholen Bakterienkolonien und wachsen sie in 3 mL LB-Medium mit Ampicillin über Nacht. Isolieren die Plasmid-DNA mit DNA Plasmid Reinigung Kit.</li>
	<li>Bestätigen die erfolgreiche Aufnahme der alpha-Kette von einem kleinen Test-Digest mit Restriktionsenzymen SnaBI und SacII. Kombinieren Sie in einem 12 µL Gesamt Reaktionsvolumen 200-500 µg Plasmid DNA, 0,25 µL jedes Enzym und 10 X Enzym Puffer (Tabelle 3). Führen Sie die Reaktion heraus auf einem 1 % Agarosegel mit Interkalation Bromid um die Größe der Band einfügen zu bestätigen (~ 500 bp).</li>
	<li>Nach der Bestätigung der Anwesenheit des Einsatzes, Reihenfolge den TCR-Alpha-Abschnitt des Vektors mit der MSCV2-Forward Primer (Tabelle 1).</li>
	<li>Nach der Überprüfung der alpha-Kette Reihenfolge überprüfen die komplette TCR einfügen durch Sequenzierung mit TCR-Beta-Reverse und IRES-Reverse Primer (Tabelle 1).</li>
</ol> 5. TCR Zelle Oberflächenexpression und Spezifität zu überprüfen.
 Hinweis: HEK293T Zellen werden verwendet, um erfolgreiche TCR Kette Pari testenNG und Zelle Oberfläche Ausdruck ( Abbildung 3A) 8. Peptid-MHC Tetramer Färbung auf den transfizierten HEK293T Zellen zu testen, für die Aufbewahrung von Antigenen Spezifität Post TCR Genisolierung ( Abb. 3 b) durchgeführt werden.
<ol><li>Platte aus HEK293T Zellen in 12-Well-Zellkultur-Platten auf 1 x 10 5 Zellen pro Bohrloch in 1 mL komplette DMEM Medien enthält 5 % FCS und Kultur über Nacht bei 37 ° c Platte genügend Zellen zu separate Brunnen für jeden neuen TCR benannt haben , Kontrolle Vorlage TCR Vektor, Vektor, CD3 Kontrolle TCR Vektor nur, und ein nicht-transfizierten gut. 
	Hinweis: Transfektion mit einer voll Maus Vorlage TCR Vektor (mTCR-pMIA) in Kombination mit mCD3εγδζ-pMIG Vektor, mTCR-pMIA Vektor allein, und mCD3εγδζ-pMIG Vektor allein dienen als positive und negative Kontrollen. 
	Hinweis: Vollständige DMEM enthält 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat, 100 µM nicht-essentiellen Aminosäuren, 5 mM HEPES-Puffer, 5.5 x 10 -5 Einheiten von 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin.</li>
	<li>Am Folgetag transfizieren Zellen mit 1 µg Chimären h/mTCR-pMIA-Vektor, 1 µg Maus CD3εγδζ-pMSCVII-GLP (pMIG) Vektor und Liposomen-basiertes Transfection Reagens nach Herstellervorschriften.</li>
	<li>Für jeden TCR 6 µL Transfection Reagens zu 100 µL Raumtemperatur serumfreien DMEM hinzufügen. Kurz Wirbel und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
	<li>In separate 1,5 mL verbinden Rohre 1 µg der TCR-pMIA-Vektor mit 1 µg Maus CD3εγδζ-pMSCVII-GLP (pMIG) Vektor oder 1 µg jeden Vektor für Steuerelemente getrennt.</li>
	<li>Dropwise, die Transfection Reagens/DMEM Lösung hinzufügen das Röhrchen mit der Vektor-DNA. Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
	<li>Dropwise, fügen Sie die Transfection Reagens/DMEM/DNA-Lösung zu den HEK293T Zellen. Klopfen Sie leicht die Platte zu mischen. Inkubation bei 37 ° C für 24 h</li>
	<li>Nach 24 h ersetzen Sie die Medien, und halten Sie Zellen in Kultur für weitere 24 h.</li>
	<li>Zellen durch kräftig Pipettieren von der Platte zu entfernen, und färben Sie die Zellen mit Anti-Maus-CD3-Antikörper (2,5 µg/mL), Oberflächenexpression von Chimären-TCR durch Durchflusszytometrie zu überzeugen.</li>
	<li>Um CD3 Ausdruck zwischen Zellen vergleichen, die auf einem ähnlichen Niveau transfiziert wurden Tor die Analyse auf Zellen, die ein ähnliches hohes Maß an fluoreszierenden Reporter Moleküle (GFP für CD3 komplex und Ametrin für TCR Expressionsvektor) zum Ausdruck zu bringen. Optimalerweise sollte die Analyse auf GFP + Ametrin + Zellen innerhalb von 10 gated werden 4 bis 10 5 Fluoreszenz Intensität ( Abb. 3A). 
	Hinweis: Die Höhe der CD3 Expression in Zellen mit Chimären Konstrukt transfiziert sollte die Kontrolle Maus (Originalvorlage) Vektor ( Abbildung 3A) vergleichbar sein. Die generierten TCR retroviralen Vektoren sind kompatibel mit in Vivo Expressionssysteme wie zuvor beschrieben 4.</li>
</ol>

<ol>
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S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice:+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer.">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).</li><li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+(TCR)+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR/CD3+stability.">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine effiziente Methode für einzelne Zelle TCR Verstärkung und nachfolgende vor-Klonen von gekoppelten TCR-Alpha und Beta-Ketten in eine Vorlage retrovirale Expressionsvektor. Obwohl mehrere einzelne Zelle PCR Protokolle entwickelt wurden, haben keine kompatibel mit sofortiger vor-Klonen in einem Ausdruck Vektor bisher. In den meisten Fällen wird eine Teilsequenz der hochvariablen CDR3 Regionen verstärkt, mit genügend Sequenz, die Variable Region zu extrapolieren. Dieser kleiner PCR...

Der T-Zell-Rezeptor (TCR) schreibt T-Zell-Schicksal-Entscheidung während der Entwicklung, Steady-State/Homöostase und Antigenen Stimulation in der Peripherie1,2,3. Jüngste Erweiterung der Deep sequencing Technologien hat eine bisher unterschätzte TCR Vielfalt in Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten aufgedeckt. TCR Vielfalt schlägt ein Potenzial für funktional Breite T-Zell-Reaktionen. Um die Sequenzanalyse Repertoire TCR TCR funktionale Tests zu integrieren, sollten die Sequenzierung Ansätze entworfen werden, kompatibel mit experimentellen Systemen und in Vivo Modelle für nachfolgende Funktionsanalyse der SELECT-Anweisung verwendet werden TCR. Wir haben einen effizienten Ansatz für menschliche TCR Sequenz Isolation entwickelt und gestrafft, vor-Klonen in einen Chimären Mensch/Maus TCR Vorlage Vektor mit TCR Ausdruck in HLA-humanisierten Mäuse4kompatibel. Isolation der entsprechenden Alpha- und Beta-Ketten des heterodimerisierenden TCR verlangt PCR Verstärkung der beiden Ketten aus einer einzigen Zelle. Obwohl einige einzellige TCR Klonen Protokolle entwickelt und genutzt haben, wurden keiner bisher problemlos kompatibel mit Hochdurchsatz-optimierte direkte Klonen unbekannter Vα/Vβ TCRs in retrovirale Vektoren für erneuten Ausdruck in-vivo notwendig 4,5,6,7. Frühere Studien haben zwei Hauptansätze, entweder um einen begrenzten Teil des TCR ausreichend, um die Sequenz zu extrapolieren oder verstärken die gesamte TCR Sequenz4,5,6 selektiv zu verstärken genutzt. , 7. Downstream Funktionsanalyse des TCR Sequenzen erhalten über den ersten Ansatz erfordert kostspielige in Silico Montage und de Novo Bau TCR. Während der zweite Ansatz die komplette TCR-Sequenz bietet, ist die menschliche konstante Region nicht in Vivo Ausdruck der geklonten TCRs in Mausmodellen vereinbar. Unser Ansatz ist speziell mit in Vivo Funktionsanalyse des TCR in Maus-Modellen kompatibel. Wir entwickelten eine effiziente und schlanke einzelligen PCR-Protokoll, das für direkte vor-Klonen der PCR-Fragmente in der Vorlage Expressionsvektor ermöglicht.
Unser Ansatz nutzt eine hochsensible Multiplex verschachtelten PCR-Reaktion, die in zwei Schritten durchgeführt wird. In der ersten Multiplex-Reaktion Schritt einen Pool von 40 Primer speziell für die V-Beta-Ketten und einen Pool von 44 Primer speziell für alles, was die V-Alpha-Ketten verwendet werden, um die TCR-Alpha oder TCR-Beta ohne Vorkenntnisse der Sequenz (Tabelle 1) zu verstärken. Der forward Primer hat eine Adapter-Sequenz, die in der 5' des PCR Produktes aufgenommen wird. Die rückwärts-Primer basiert auf die konstante Region der TCR. Wir haben ermittelt, einzigartige Restriktionsschnittstellen, die aus menschlichen Variable oder Kreuzung TCR Regionen fehlen, und integriert diese in neu gestalteten TCRα und TCRβ Primern (Abbildung 1). In der zweiten verschachtelte Reaktion eine Grundierung, die spezifisch für die Adapter-Sequenz und einer verschachtelten rückwärts-Primer in der konstanten Region dienen weiter verstärken die TCR-Ketten mit erhöhte Spezifität (Tabelle 1, Abb. 1). Nach einzelnen Zelle isoliert, zwei Runden der PCR (erste Reaktion mit einem Pool von Vα und Vβ Primern, und zweitens mit Adapter Primern) führen ein PCR-Produkt, das direkt in die Vorlage retroviral Vektor Sub geklont werden kann. Das endgültige TCR-Konstrukt wird in eine einzelne offene Leserahmen (ORF), menschlichen Variablen Regionen kombiniert mit Maus konstante Regionen durch die "Self anhaftenden" Proteinsequenz verbunden kodieren P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. Der P2A-Sequenz wurde in mehreren Systemen eingesetzt und wurde speziell für den Ausdruck von TCR8,9,10,11ausgiebig getestet. Obwohl, nach Übersetzung P2A Sequenz bleibt der Großteil an dem C-Terminus der alpha-Kette durch eine flexible Linker verbunden, während der Beta-Kette Signalsequenz eine zusätzliche Prolin, diese Änderung hat hat keine nachteiligen Auswirkungen auf die TCR-Funktion. Die konstante Region der Maus wird in das Konstrukt statt Menschen verwendet, um mögliche veränderte Interaktionen mit nachgeschalteten Signalisierung Komponenten zu vermeiden wenn wieder in Mauszellen exprimiert. Die einzige ORF führen stöchiometrische separater Ausdruck von Alpha- und Beta-Ketten9,11. Das aktuelle Protokoll basiert auf Reagenzien und Ansätze, die überall erhältlich sind, und soll in einer schlanken und effizienten Art und Weise durchgeführt werden. Obwohl wir diese Technik speziell zur TCR von selbstzersetzliche T-Zellen in autoimmune Diabetes verwickelt assay verwendet haben, erwarten wir, dass dieses Protokoll allgemein anwendbar zur Identifizierung und funktionelle Beurteilung menschlichen TCRs spezifisch für sind autoimmune Epitope, Krebs Epitope oder Reaktionen auf Krankheitserreger und Impfstoffe.

<table><tbody><tr><td>CFSE&amp;nbsp;</td><td>eBioscience&amp;nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>anti-human CD4 (OKT4) BV421</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>317433</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-mouse CD3 AF647</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>100322</td><td>2.5 mg/mL</td></tr><tr><td>Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0.7 U</td></tr><tr><td>Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit&amp;nbsp;</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U (RT enzyme)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNA polymerase 2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96 Well Half Skirt PCR Plate</td><td>Phenix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Clear Adhesive Film&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&amp;nbsp;</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U (insert) 30 U (vector)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>Calf Intestinal Phosphatase (CIP)</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>Quick ligase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus minipreps DNA purification systems&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus midipreps DNA purification systems&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>DNA clean &amp;amp; concentrator-25 kit</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 DNA clean &amp;amp; concentrator-5 kit</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>11-306A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent)</td><td>Mirus&amp;nbsp;</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II (sorter)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (flow cytometer)</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

streamlined single cell tcr isolation and generation of retroviral vectors for in vitro and in vivo expression of human tcrs

Obwohl mehrere Methoden für die Sequenzierung von gepaarten T-Zell-Rezeptor (TCR) Alpha- und Beta-Ketten aus einzelnen T-Zellen entwickelt wurden, wurden keine bisher förderlich für nachgeschaltete in Vivo Funktionsanalyse des TCR Heterodimere. Wir haben eine verbesserte Protokoll basiert auf einem zweistufigen Multiplex nested PCR, resultiert in einer PCR-Produkt, das gesamte Variable Regionen eine menschliche TCR-Alpha und Beta-Ketten umfasst entwickelt. Durch die einzigartige Restriktionsschnittstellen Identifizierung und Einbindung in die PCR-Primer, haben wir das PCR-Produkt mit direkten vor-Klonen in der Vorlage retroviral Vektor kompatibel gemacht. Das daraus resultierende retrovirale Konstrukt kodiert eine Chimäre Mensch/Maus TCR mit einer Maus intrazelluläre Domäne in Mauszellen oder in Vivo Maus-Modellen funktioniert. Insgesamt verbindet das Protokoll hier beschriebenen menschlichen Einzelzelle gepaart TCR Alpha- und Beta-Kette Identifikation mit optimierten Generation von retroviralen Vektoren leicht anpassbar für in Vitro und in Vivo TCR Ausdruck. Das Video und das Begleitmaterial sollen eine sehr detaillierte Beschreibung der einzelnen Zelle PCR, vermitteln, dass die entscheidenden Schritte gefolgt und mögliche Fallstricke vermieden werden können. Darüber hinaus bieten wir eine ausführliche Beschreibung der Klonen Schritte notwendig, um dem Expressionsvektor erzeugen. Sobald Sie beherrscht, konnte die ganze Prozedur von Einzelzelle Sortierung TCR Ausdruck in einem kurzen Zeitraum von zwei Wochen durchgeführt werden.

Die Effizienz der Multiplex-nested PCR Reaktion in Schritt 3.2.7 (Abbildung 2) Prüfung: 5µL die zweite Reaktion auf einem Agarosegel zur Neige. Im Durchschnitt ist die Effizienz der TCR-Beta-Verstärkung bei etwa 80 %, während die Effizienz der TCR-Alpha Reaktion in der Regel niedriger, bei etwa 50 ist % rechnen4. Nur paarweise TCR-Alpha und TCR-Beta-Ketten können für TCR Ausdruck verwendet werden; jedoch konnten alle PCR Produkte...

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Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Das aktuelle Protokoll kombiniert, die einzelne Zelle menschlichen TCR Alpha- und Beta-Kette Sequenzierung mit gepaart gestrafft Generation kompatibel mit in Vitro und in Vivo TCR Ausdruck retroviralen Vektoren.

Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

streamlined-single-cell-tcr-isolation-generation-retroviral-vectors

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

9.4K Aufrufe.  Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital. Das aktuelle Protokoll kombiniert, die einzelne Zelle menschlichen TCR Alpha- und Beta-Kette Sequenzierung mit gepaart gestrafft Generation kompatibel mit in Vitro und in Vivo TCR Ausdruck retroviralen Vektoren.

Serie: Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based on the identification of Treg through several activation-dependent cellular surface markers with varying expression levels in different physiologic and pathologic conditions. Populations isolated as &#8220;Treg&#8221; therefore often contain considerable numbers of non-Treg effector cells (i.e., Teff) which hamper the precise phenotypic and functional characterization of these cells, their genomic and proteomic characterization, their reliable enumeration in different states of health and disease, as well as their isolation and expansion for therapeutic purposes. The latter, in particular, remains a major hurdle, as the inadvertent expansion of effector cells homing in Treg-relevant cellular compartments (e.g., CD4+CD25+ T cells) may render Treg-based immunotherapy ineffective, or even harmful. This work presents a method that circumvents the problems associated with population-based isolation and expansion of Treg and shows that the generation of Treg candidate clones with the subsequent selection, culture, and expansion of only carefully vetted, monoclonal cells, enables the generation of an ultrapure Treg cell product that can be kept in culture for many months, enabling downstream investigation of these cells, including for possible therapeutic applications.

This protocol describes the cloning and expansion of human regulatory T cells for the generation of ultra-high purity viable human Treg with stable demethylation at the Treg-specific demethylated region (TSDR) and Treg-specific phenotypic features.

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Optimiertes Protokoll für die Generierung von CAR-T-Zellen der Maus in syngenen Modellen

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological malignancies and are presently undergoing development for the treatment of diverse solid tumors. So far, the preliminary evaluation of novel CAR-T cell products has predominantly taken place in xenograft tumor models using immunodeficient mice. This approach is chosen to facilitate the successful engraftment of human CAR-T cells in the experimental setting. However, syngeneic mouse models, in which tumors and CAR-T cells are derived from the same mouse strain, allow evaluation of new CAR technologies in the context of a functional immune system and comprehensive tumor microenvironment (TME). The protocol described here aims to streamline the process of mouse CAR-T cell generation by presenting standardized methods for retroviral transduction and ex vivo T cell culture. The methods described in this protocol can be applied to other CAR constructs beyond the ones used in this study to enable routine evaluation of new CAR technologies in immune-competent systems.

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der CAR-T-Zellfunktion in syngenen Tumormodellen 

This protocol streamlines retroviral vector production and murine T cell transduction, facilitating the efficient generation of mouse CAR-T cells.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological ...

Biotechnik

<meta charset="utf8"></head><body>Retrovirale Transduktion von Guide-RNA zur Geneditierung bei der Th17-Differenzierung

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells can be stimulated with antigens and well-defined cytokine cocktails in vitro to mimic Th17 cell differentiation in vivo. Research has been conducted extensively on the Th17 differentiation regulation mechanisms using the in vitro Th17 polarization assay.
Conventional Th17 polarization methods typically involve obtaining na&#239;ve CD4 T cells from genetically modified mice to study the effects of specific genes on Th17 differentiation and function. These methods can be time-consuming and costly and may be influenced by cell-extrinsic factors from the knockout animals. Thus, a protocol using retroviral transduction of guide RNA to introduce gene knockout in CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cells serves as a very useful alternative approach. This paper presents a protocol to differentiate na&#239;ve primary T cells into Th17 cells following retroviral-mediated gene targeting, as well as the subsequent flow cytometry analysis methods for assaying infection and differentiation efficiency.

<meta charset="utf8"></head><body>Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

We present a protocol for retroviral transduction of guide RNA into primary T cells from Cas9 transgenic mice, providing an efficient alternative for gene editing in studying Th17 differentiation.

Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

Generieren

Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro