Name: real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 und P3013330 von den National Institutes of Health. Wir möchten Michele Houston, Elena Dhima und Dr. Anna Velcich für ihre wertvollen Kommentare bei der Entwicklung der Krypta Isolierungsprotokoll danken. Wir danken auch den Diabetes-Schulungen und Forschungszentrum in der Albert Einstein College of Medicine vom NIH P60DK20541 unterstützt, und Dr. Michael Brownlee und Dr. Xue-G. Richter, der direkt und Betrieb der Seahorse Anlage verbunden.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Ausschuss für die Ethik der Tierversuche des Albert Einstein College of Medicine genehmigt. 1. Crypt Isolierung und Kultur <ol><li> Isolierung von Krypten aus dem Dünndarm: <ol><li> Isolieren Darmkrypten aus jedem Mausmodell von Interesse. Euthanize die Mäuse mit CO 2, gefolgt durch zervikale Dislokation. </li><li> Öffnen Sie den Bauch längs und füllen den Dünndarm (SI) mit eiskaltem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, PBS (-Ca 2+; -Mg 2+) mit 2x Antibiotika-Antimykotika (anti-anti). Rasch zu isolieren Dünndarm. </li><li> Gründlich sezieren frei von mesenterialen Fett mit einem Skalpell. Achten Sie darauf, um das Gewebe zu perforieren - jederzeit feucht mit eiskaltem PBS halten das Gewebe. Öffnen Sie inteStine längs und gründlich mit eiskaltem PBS. </li><li> Schneiden Sie Dünndarm in zwei Abschnitte und flach aus mit einem feuchten Wattestäbchen vorsichtig abkratzen Zotten mit einem vorgekühlten Rutsche. Kräftig in eiskaltem PBS mehrmals waschen. </li><li> Inkubieren 3 min in 20 ml 1x PBS pro 3 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) /0.5 mM Dithiothreitol (DTT) für nicht-enzymatische Dissoziation des Gewebes. </li><li> Geschnitten Gewebe in kleine Stücke (2-4 mm) mit einer Rasierklinge auf einem vorgekühlten Folie. Übertragen Sie die Stücke in einen 50-ml-Tube mit 20 ml eiskaltem PBS. </li><li> Pipette nach oben und unten vorsichtig 10x mit einem 10 ml sterile Einwegpipette. Lassen Gewebefragmente zu sedimentieren durch die Schwerkraft. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie drei weitere Male; stellen Sie sicher, Überstand klar ist. </li><li> 20 ml PBS pro 2 mM EDTA. Swirl und Inkubation bei 4 ° C für 30 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Lassen Gewebe Sediment und Überstand verwerfen. 15 ml eiskaltem PBS und Pipettennach oben und unten 5x mit einer 10 ml Pipette. Lassen Sie die Gewebefragmente Sediment zu sammeln und das Überstand als Fraktion 1 (F1). Wiederholen Sammeln F2-F5, jede Fraktion getrennt gehalten. </li><li> 15 ml eiskaltem PBS und diesmal unter kräftigem Schütteln für 15 Sekunden. Sammeln Sie F6 und wiederholen Sie für F7, F8. Wenn Gewebestücke beginnen zu schweben, tippen, um ihnen helfen zu begleichen. </li><li> Untersuchen Sie ein Aliquot jeder Fraktion unter dem Mikroskop. Pool jene Fraktionen, die Krypten. </li><li> Übergeben Sie die gesammelten Fraktionen durch einen 70 &amp; mgr; m Nylon Zellsieb, Sammeln Krypten in einem 50-ml-Tube. </li><li> Zentrifuge bei 100 xg für 5 min bei 4 ° C, den Überstand verwerfen und Pellet in 10 ml eiskaltem PBS mit 2x Anti-Anti und Transfer Krypten in ein 15-ml-Tube. Wiederholen Sie den Wasch noch einmal. </li><li> 2x Anti-Anti - einmal mit 10 ml eiskaltem ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco &quot;s Modified Eagle Medium / Ham&quot; s F-12) Waschen Sie die Krypten. </li><li> Waschen Sie die Krypten einmal mit 10 ml ADF - 1x Anti-Anti. </li><li> Zählen Sie die Krypten mit einer Zählkammer. Passen Sie die Krypta Lösungsvolumen und Transfer zu einem 1,5-ml-Röhrchen, so dass die endgültige Krypta Konzentration bei resuspendiert wird 100-500 Krypten pro 50 ul gallertartige Proteinmischung (Matrigel) sein. Zentrifuge bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C und resuspendieren Krypten im gelartigen Proteingemisch. </li><li> Platte 50 ul Krypta - gallertartig Proteingemisch Suspension pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte (Wachstumsbereich: 2 cm 2), sorgfältig Platzierung der Aufhängungseinbruch in der Mitte jeder Vertiefung. Pflegen Sie die Platte in einem CO 2, 37 ° C Inkubator für ~ 30 min, bis die Suspension verfestigt. </li><li> In 500 ul eiskaltem komplette Kulturmedien (Advanced DMEM / F12 mit 1x Anti - Anti, 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27 Supplement, 1x N2 Supplement, 1 mM N-Acetyl-L-Cystein (NAC), 50 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R-Spondin). <ol><li> Rekonstitution Wachstumsfaktoren in 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS. </li></ol></li></ol></li><li> Crypt Organoide Kultur und Passage: <ol><li> Passage Krypta Organoiden 14-21 Tage nach der Aussaat (oder nach Bedarf) wie folgt: <ol><li> Ändern Medien jeden Freitag und Montag. Mittwochs, ersetzen die Hälfte der Medien mit frischem Medium. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium. Die Probe zweimal Waschen mit 500 ul PBS bei 5-Minuten-Intervallen. </li><li> Entfernen PBS und sanft brechen die gallertartige Proteinmischung mit einem sterilen P1000 Mikropipettenspitze. </li><li> 1 ml komplettes Kulturmedien auf ein einziges gut und resuspendieren Organoiden in 1 ml Medium. </li><li> Sanft stören die Organoiden mit einem P1000 durch Auf- und Abpipettieren 20-30x (Check unter dem Mikroskop für die ordnungsgemäße Organoid Dissoziation mit einer guten Ausbeute Krypta bis eine einheitliche Technik wird entwickelt). </li><li> Übertragen Sie die Krypten in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen;Zentrifuge bei 100 × g bei 4 ° C, 5 min. </li><li> Zweimal Waschen des Pellets mit 1 ml komplettem Kulturmedien. </li><li> Split in einem Verhältnis von 1: 3 oder 1: 6 wie erforderlich, Resuspendieren Krypten in 50 &amp; mgr; l Matrigel pro Vertiefung. Gehen Sie wie oben (Abschnitt 1.1.16-18) beschrieben. </li></ol></li><li> Crypt Organoide Freezing: <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium. Die Probe in 500 ul PBS waschen. </li><li> Verteilen das gallertartige Proteinmischung mit einem P1000 Pipettenspitze. </li><li> 1 ml Medium auf ein einziges gut und resuspendieren Organoiden in 1 ml Medium. </li><li> Vorsichtig brechen die Organoiden mit einem P1000 durch Auf- und Abpipettieren 20-30x. </li><li> Übertragen Sie die Organoiden in ein 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 100 × g bei 4 ° C, 5 min. </li><li> Zweimal Waschen des Pellets mit 1 ml komplettem Kulturmedien. </li><li> Resuspendieren Krypten in 500 ul gefrierenden Medien. </li><li> Transfer Krypten zu einem Kryoröhrchen, den Schlauch in einem Gefrierbehälter und Speicher in einem -80 ° C Gefrierschrank overnight. </li><li> Übertragen Krypten zu flüssigem N 2 Tank. <ol><li> Recover gefrorenen Krypta Organoiden durch schnelles Auftauen in einem 37 ° C Wasserbad. Waschen mit 500 ul komplettem Kulturmedium einmal, Zentrifuge bei 100 × g, 5 min und resuspendieren in gelatinösen Proteingemisch, und die Kultur wie oben beschrieben. Für bessere Erholung, fügen ROCK-Inhibitor (Y-27632) mit dem gefrierenden Medien. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Crypt Organoide Stoffwechsel Assay <ol><li> 24-Well-Platte Zubereitung: <ol><li> Isolieren und zählen Krypten nach dem Protokoll (siehe Abschnitt 1.1 für crypt Isolation und Abschnitt 1.2 für crypt Durchgang). </li><li> Resuspendieren Krypten in gallertartigen Proteinmischung (100-200 Krypten pro 20 ul). </li><li> Platte Krypta-gallertartige Proteingemisch Suspension in einem 24-Well-Assayplatte (stellen Sie sicher, es gibt mindestens dreifacher Ausführung für jede Probe) und lassen Sie die Suspension bei 37 ° C in einem CO 2 zu verfestigenInkubator; fügen Sie dann 500 ul komplette Kulturmedien. </li><li> Kultur Krypten (wie in Abschnitt 1.1 beschrieben) und beobachten unter dem Mikroskop bis Krypten in voll entwickelten Organoiden wachsen. </li></ol></li><li> Extracellular Flux Assay: <ol><li> Hydrat Patrone über Nacht in einem Nicht-CO 2 (0% CO 2), 37 ° C Inkubator. </li><li> Entfernen des Kulturmediums und waschen Organoiden zweimal mit 500 &amp; mgr; l DMEM (ohne: Glucose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat, und mit: Phenolrot). Warten Sie 5 min. </li><li> Gib 675 &amp; mgr; l pro Vertiefung Testmedium (DMEM mit 2 mM L-Glutamin und 5 mM D-Glucose) in jede Vertiefung. </li><li> Überprüfen Krypta Organoiden mikroskopische Morphologie, um sicherzustellen, dass Organoiden und die gallertartige Proteinmischung intakt nach den Wäschen sind. Inkubieren für 1 Stunde in einer nicht-CO 2, 37 ° C Inkubator. </li><li> Herstellung von 10 &amp; mgr; M injizierbaren Verbindungen (Oligomycin, Carbonylcyanid-p-Trifluor-methoxy-phenyl-Hydrazon (FCCP), rotenone) in Testmedium. </li><li> Set-up die Patrone durch das Laden 75 ul 10 uM injizierbaren Verbindungen in die Häfen der Kartusche nacheinander: Port A - Oligomycin; Port B - FCCP; und Port C - Rotenon (Die Endkonzentrationen während des Assays wird 1 &amp; mgr; M). </li><li> Inkubieren Kassette 30 min - 1 h bei 37 ° C in einer nicht-CO 2 -Inkubator. </li><li> Gleichzeitig schalten Sie den XF Analyzer und erstellen Sie die Assay-Protokoll-Vorlage. </li><li> Zeigen Patrone und Gebrauchsplatte in XF Analyzer und führen Sie &quot;Kalibrieren&quot; Patrone. </li><li> Überprüfen Krypta Organoiden mikroskopisch sicherstellen, dass sie auf die gallertartige Proteingemisch gebunden sind. </li><li> Lastzellkulturplatte in Instrument und führen Testprotokoll. </li></ol></li></ol>

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Wir testeten die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die extrazelluläre Ansäuerung Rate (ECAR) der Krypten von 8 Monate alten Mäusen isoliert und in Organoiden ex vivo gewachsen. Nach Messung der Basalrate wurde Krypta Stoffwechsel durch Zugabe Oligomycin, Carbonylcyanid bewertet -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) und Rotenon, nacheinander. 29 min (2A und 2B) - basale OCR und basalen ECAR wurden aus 0 aufgezeichnet. Am 29. min, O...

Darmkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Ursache der durch Krebs Todesfälle in den Vereinigten Staaten. Sporadische Darmkrebs - das heißt, dass die sich später im Leben (&gt; 50 Jahre) und ohne klare prädisponierende genetische Faktoren - Konten für ~ 80% aller Fälle, mit Einfalls stark durch langfristige Ernährungsmuster 1,2 beeinflusst. Diese Tumoren weisen eine metabolische Verschiebung hin Abhängigkeit oxidative Glykolyse als Warburg-Effekt bekannt, das zum Teil machen können höhere Konzentrationen der Zellbausteine ​​und Energie zur Verfügung (über Glutaminolyse) zu hohen Raten der Tumorzellproliferation 3-5 gestatten und vielleicht fahren . Studien von Darmkrebs sowie anderen gastrointestinalen Tumoren einschließlich Dünndarm Krebsarten liefern wichtige Einblicke in die Ursache der Tumorbildung. Untersuchung der Stoffwechselunterschiede zwischen normalen, pro-tumor und tumorerzeugende Staaten von gastrointestinalen Organsysteme kann det unterstützenermination des relativen Risikos für die Tumorentwicklung sowie Früherkennung von Neoplasien. Darüber hinaus verstehen bioenergetischen Stoffwechsel mit mitochondriale Atmung und Glykolyse liefert grundlegende Einblicke in die Zellphysiologie, Altern und Krankheitszustand stört Darm Homöostase. Nutzung der Bioenergetik Assay-Technologie für extrazelluläre Flussanalyse können die Preise der mitochondrialen Atmung und Glykolyse gleichzeitig in wachsenden Zellen in Kultur in Echtzeit 6,7 bewerten. Bis vor kurzem wurden in vitro Untersuchungen von Dünndarmzelllinien entweder benigne oder maligne Tumoren 8,9 abgeleitet sind und nicht die Physiologie der normalen Darm Epithelien und den Einfluss der Mikroumgebung, in dem sie sich aufhalten darstellen. Im Jahr 2009, Sato et al. 10 führte eine ex vivo Kultursystem zur dreidimensionalen (3D) Maus Darmepithelzellen Organoiden wachsen oder epithElial &quot;Mini-Mumm&quot;, geeignet für experimentelle, diagnostische und therapeutische Untersuchungen 10,11. Außerdem Krypten von kalorisch eingeschränkt Mäusen isoliert behalten ihre veränderte Wachstumseigenschaften wie Organoiden in solchen Kulturen 12. Im Vergleich zu transformierten Zelllinien können Krypta organoide Kulturen verwendet, um physiologisch relevante Daten präsentiert ein weit besseres Modell für die in vivo-Zustand zu verstehen erzeugen. Wir angepasst Bioenergetik-Analyse-Technologie, um den Energiestoffwechsel der Darm Krypta Organoiden testen. Maus Darm Krypta Organoiden kultiviert wurden ex vivo zur Krypta Organoid Energiestoffwechsel Studien vorgestellt zu entwickeln. Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) der Krypta Organoide wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von zwei unterschiedlichen Stoffwechselinhibitoren (Oligomycin, Rotenon) und ein Ionenträger (Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) gemessen. Die Krypta organoid metabolische Reaktion auf diese chemischen Verbindungen wurden erfolgreich durch wechselnde ECAR und OCR-Werte wider. Cellular bioenergetischen Untersuchungen werden die gegenseitigen Wechselwirkungen zwischen Stoffwechsellage und Krankheitsrisiko und Phänotyp bei Krebs, Fettleibigkeit, Diabetes, Stoffwechselstörungen und mitochondrialen Erkrankungen aufzuklären und helfen Voraus Screening-Methoden mit unmittelbaren Auswirkungen für translationale Medizin. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für kleine Darmkrypten isolieren und Kultur Krypta Organoiden. Darüber hinaus führen wir eine neuartige Methode zur Krypta Organoid Kulturen für metabolische Assays verwenden.

<table><tbody><tr><td>BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;prime;s Modified Eagle&amp;prime;s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - &lt;strong&gt;step 2.2.2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Final concentration 1x or 2x</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin, liquid</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; GlutaMAX&amp;trade; supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Final concentration 10 mM</td></tr><tr><td>N-acetyl-L-cysteine, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Final concentration 1 mM</td></tr><tr><td>100x N-2 supplement, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&amp;reg; supplement minus Vitamin A, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 &amp;mu;g</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Final concentration 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Murine EGF, 100 &amp;mu;g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Final concentration 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Murine Noggin, 20 &amp;mu;g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Final concentration 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; L-glutamine, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Final concentration 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; glucose powder</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>Final concentration 5 mM</td></tr><tr><td>Ambion&amp;reg; 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>Final concentration 3 mM for &lt;strong&gt;step 1.1.5&lt;/strong&gt;; 2 mM for &lt;strong&gt;step 1.1.8&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DTT (dithiothreitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Final concentration 3 mM</td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0.1% in PBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1% in PBS</td></tr><tr><td>Recovery&amp;trade; Cell Culture Freezing Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Final concentration 10 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Final concentration 0.1 N in PBS</td></tr><tr><td>XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures

Die Dünndarmschleimhaut weist eine sich wiederholende Architektur in zwei Grundstrukturen organisiert: Zotten, in das Darmlumen vorspringende und reifer Enterozyten, Becherzellen und enteroendokrinen Zellen zusammengesetzt; und Krypten, wohnhaft proximal der Submukosa und Muskularis, Beherbergung adulten Stammzellen und Vorläuferzellen und reife Panethzellen sowie Stromazellen und Immunzellen der Krypta Mikroumgebung. Bis zu den letzten Jahren, in vitro Untersuchungen von Dünndarm wurde, um Zelllinien entweder benigne oder maligne Tumoren abgeleitet sind, und nicht die Physiologie der normalen Darm Epithelien und den Einfluss der Mikroumgebung, in dem sie sich aufhalten darstellen. Hier zeigen wir ein Verfahren von Sato et al angepasst. (2009) für die Kultivierung von primären Maus-Darm-Krypta Organoide von C57BL / 6-Mäusen abgeleitet sind. Darüber hinaus präsentieren wir die Verwendung von crypt Organoid Kulturen, um die Krypta metabolische Profil in Echtzeit von Maßnahme zu testenment der basalen Sauerstoffverbrauch, glykolytischen Rate, die ATP-Produktion und Atemkapazität. Organoiden aufrechtzuerhalten Eigenschaften durch ihre Quelle definiert und Aspekte ihrer metabolischen Anpassung durch den Sauerstoffverbrauch und die extrazelluläre Ansäuerung Raten wider behalten. Echtzeitstoffwechselstudien in dieser Krypta Organoid Kultursystem sind ein leistungsfähiges Werkzeug zur Krypta Organoid Energiestoffwechsel zu untersuchen, und wie sie durch Ernährungs- und pharmakologischen Faktoren moduliert werden.

Crypt Organoiden wurden 8 Monate alten C57BL / 6-Mäusen etabliert gereinigt Nagerfutter American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Intestinale Krypta Organoiden können in Kultur über einen längeren Zeitraum von einem einzigen crypt (1A, einzelne rote Pfeil) angebaut werden. Organoiden wachsen aus Krypta-ähnliche Strukturen in 18-20 Tagen in Kultur (1B, rote Pfeile). Krypten wurden alle 3 Wochen agiert und Organoiden effizient nach jedem Durchgang gewonnen. <p class="jove_con...

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Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Dünndarm Krypta Organoiden kultiviert ex vivo eine Gewebekultursystem, das Wachstum der Krypten abhängig Stammzellen und ihrer Nische rekapituliert. Wir haben eine Methode, um das metabolische Profil in Echtzeit in der primären Maus Krypta Organoiden testen. Wir fanden Organoiden aufrechtzuerhalten physiologischen Eigenschaften von ihrer Quelle definiert.

Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Intestinale Crypt Organoide Kulturen

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

16.2K Aufrufe.  Albert Einstein College of Medicine.  Dünndarm Krypta Organoiden kultiviert ex vivo eine Gewebekultursystem, das Wachstum der Krypten abhängig Stammzellen und ihrer Nische rekapituliert. Wir haben eine Methode, um das metabolische Profil in Echtzeit in der primären Maus Krypta Organoiden testen. Wir fanden Organoiden aufrechtzuerhalten physiologischen Eigenschaften von ihrer Quelle definiert. 

Serie: Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Krebsforschung

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Immunologie und Infektion

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

Ein intestinales Darmorgankultursystem zur Analyse von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Biologie

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in response to infection or injury at the mucosal level as they are involved in antimicrobial responses and wound healing. They are also critical secondary messengers, regulating several pathways, including cell growth and differentiation. On the other hand, excessive ROS levels lead to oxidative stress, which can be deleterious for cells and favor intestinal diseases like chronic inflammation or cancer. This work provides a straightforward method to detect ROS in the intestinal murine organoids by live imaging and flow cytometry, using a commercially available fluorogenic probe. Here the protocol describes assaying the effect of compounds that modulate the redox balance in intestinal organoids and detect ROS levels in specific intestinal cell types, exemplified here by the analysis of the intestinal stem cells genetically labeled with GFP. This protocol may be used with other fluorescent probes.

The present protocol describes a method to detect reactive oxygen species (ROS) in the intestinal murine organoids using qualitative imaging and quantitative cytometry assays. This work can be potentially extended to other fluorescent probes to test the effect of selected compounds on ROS.

Analyse von oxidativem Stress in murinen Darmorganoiden mit reaktiver Sauerstoffspezies-sensitiver fluorogener Sonde

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

3D-Kultur von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einzelnen Stammzellen

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

Autor im Rampenlicht: Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in

Zusammenfassung

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Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

Das

Ein intestinales Darmorgankultursystem zur Analyse von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen

Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Analyse von oxidativem Stress in murinen Darmorganoiden mit reaktiver Sauerstoffspezies-sensitiver fluorogener Sonde

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung