Name: real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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この研究は、国立衛生研究所からの助成金RO1 CA 135561、R01 CA151494、R01 CA174432およびP3013330によってサポートされていました。 私たちは、陰窩単離プロトコールを開発する上で彼らの貴重なコメントミケーレヒューストン、エレナDhima博士アンナVelcichに感謝したいと思います。 我々はまた、直接、それぞれ、タツノオトシゴ施設を運営糖尿トレーニングおよびNIH P60DK20541でサポートされているアルベルト·アインシュタイン医学校の研究センター、博士マイケル·ブラウンリー博士と雪-梁デュを、感謝します。

この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨に従って行った。プロトコルは、アルベルト·アインシュタイン医学校の動物実験の倫理委員会によって承認された。 1.陰窩単離および培養<ol><li>小腸から陰窩の単離： <ol><li>関心のある任意のマウスモデルから腸陰窩を分離します。頸椎脱臼に続いてCO 2を持つマウスを安楽死させる。 </li><li>縦方向に腹部を開き、氷冷リン酸緩衝生理食塩水、PBS（-Ca 2+ -Mg 2+）と小腸（SI）を埋める2倍の抗生物質-抗真菌（抗抗）で。急速に小腸を分離します。 </li><li>徹底的にメスを用いて腸間膜脂肪の自由な解剖。組織を穿孔しないように注意してください - すべての回での氷冷PBSで湿った組織を保つ。 INTEを開く縦方向スタイン、氷冷PBSで徹底的に洗浄してください。 </li><li>予冷されたスライドを使用して絨毛を掻き優しく、2セクションに小腸をカットし、湿った綿棒を使って平ら。氷冷PBS数回激しく洗う。 </li><li> 3mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）当たり20ミリリットル1×PBS中で3分間インキュベート/0.5 mMのは、組織の非酵素的解離のためにジチオスレイトール（DTT）。 </li><li>予冷されたスライド上のカミソリの刃を使用して小片（2-4 mm）の中に組織を切断。 20ミリリットルの氷冷PBSを含む50ミリリットルチューブに作品を転送します。 </li><li>ピペットは、上下優しく10xの10ミリリットルの無菌の使い捨てピペットを用いて。組織片が重力によって沈降してみましょう。ピペットで上清を取り除きます。さらに3回繰り返します。上清が透明であることを確認してください。 </li><li> 2mMのEDTAあたり20mlのPBSを追加します。スワールとは穏やかに揺らしながら30分間、4℃でインキュベートする。 </li><li>組織土砂を聞かせて、上清を捨てる。 15ミリリットルの氷冷PBSおよびピペットを追加上下5倍10ミリリットルピペットで。組織片が堆積しましょう​​と画分1（F1）として上清を収集します。 F2-F5キーを収集を繰り返し、各分画を別々に維持した。 </li><li> 15ミリリットルの氷冷PBSと、この時間は15秒間手で激しく振る追加。 F6キーを収集し、F7、F8のために繰り返します。組織片が浮いて起動した場合、彼らが定住を支援するをタップします。 </li><li>顕微鏡下で各画分のアリコートを点検。陰窩を含む画分をプールする。 </li><li> 50ミリリットルチューブに陰窩を集め、70μmのナイロン細胞ストレーナーを通してプールした画分を渡します。 </li><li> 4℃で5分間100×gで遠心し、15mlチューブに2X抗抗転送陰窩と10ミリリットルの氷冷PBSに上清を再懸濁ペレットを捨てる。洗浄をもう一度繰り返します。 </li><li> 2X抗 - 抗 - 10ミリリットルの氷冷ADF、アドバンストDMEM / F-12（ダルベッコ &quot;sは改変イーグル培地/ハム&quot; S F-12）で一度陰窩を洗ってください。 </li><li> 10ミリリットルAで一回陰窩を洗うDFは - 抗 - 抗1倍。 </li><li>血球計数器を用い陰窩を数える。陰窩溶液量を調整し、再懸濁させ、最終的な暗号濃度はゼラチン状タンパク質混合物（マトリゲル）を50μlあたり100〜500陰窩になるよう1.5mlチューブに移す。ゼラチン状のタンパク質混合物中で4℃、再懸濁陰窩で5分間100×gで遠心。 </li><li>陰窩のプレートに50μl - 24ウェルプレート中でウェルあたりゼラチン状のタンパク質混合懸濁液（成長分野：2 cm 2）を 、慎重に各ウェルの中央にサスペンションの低下を置く。 CO 2に懸濁液が固化〜30分まで、37℃のインキュベーターをプレートを維持する。 </li><li>抗、10 mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、1xのグルタMAX、1X B27サプリメント、1×N2サプリメント、1 mMの - 500μlの氷冷完全培養培地（1×抗による高度なDMEM / F12を追加N-アセチル-L-システイン（NAC）、50ng / mlの上皮増殖因子（EGF）、100ng / mlのノギン、500 / mlのRスポンジン）。 <ol><li> PBS中の0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）中で増殖因子を再構成する。 </li></ol></li></ol></li><li>陰窩オルガノイド文化とパッセージ： <ol><li>通過陰窩オルガノイド14-21日後に播種（または必要に応じて）次のように： <ol><li>変化媒体毎週金曜日と月曜日。水曜、新鮮な培地で半分メディアを交換。 </li></ol></li><li>培養液を除去します。 5分間隔で500μlのPBSで2回サンプルを洗ってください。 </li><li> PBSを外し、静かに滅菌P1000マイクロピペットチップを使用したゲル状のタンパク質混合物を壊す。 </li><li>単一のウェルに1ミリリットルの完全培養培地を追加し、1ミリリットルのメディアにおけるオルガノイドを懸濁します。 </li><li>優しく（一貫性のある技術が開発されるまでの良い暗号収量との適切なオルガノイド解離のために顕微鏡下で確認してください）​​にピペッティングによって20-30xダウンP1000を使用してオルガノイドを混乱させる。 </li><li> 1.5ミリリットルマイクロチューブへ陰窩を移す。4℃、5分で100×gで遠心する。 </li><li> 1ミリリットルの完全培養培地で二回ペレットを洗浄。 </li><li> 3または1：1の割合で分割6必要に応じて、ウェルあたり50μlのマトリゲルにおける陰窩を再懸濁する。 （ セクション1.1.16-18）、上述のように実行します。 </li></ol></li><li>墓所オルガノイド凍結： <ol><li>培養液を除去します。 500μlのPBSにサンプルを洗ってください。 </li><li> P1000のピペットチップを用いてゲル状のタンパク質混合物を分散させる。 </li><li>単一のウェルに1ミリリットルのメディアを追加し、1ミリリットルのメディアにおけるオルガノイドを懸濁します。 </li><li>優しく上下20-30xピペッティングすることによりP1000を使用してオルガノイドを破る。 </li><li> 1.5ミリリットルチューブにオルガノイドを転送します。 4℃、5分で100×gで遠心。 </li><li> 1ミリリットルの完全培養培地で二回ペレットを洗浄。 </li><li>メディアを凍結500μlの中で再懸濁陰窩。 </li><li>クライオチューブへの転送陰窩は、-80℃の冷凍庫overniに冷凍コンテナとストア内チューブを配置GHT。 </li><li>液体N 2タンクに陰窩を転送します。 <ol><li>急速に37℃の水浴中で解凍し凍結した陰窩オルガノイドを回復します。前述のように100×gで、ゼラチン状のタンパク質混合物中で5分間再懸濁し、文化で500μlの完全培養ワンスメディア、遠心分離機を洗ってください。より良い回復のために、凍結メディアにROCK阻害剤（Y-27632）を追加します。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.クリプトオルガノイド代謝アッセイ<ol><li> 24ウェルプレートの調製： <ol><li> （陰窩通過のためのcrypt分離およびセクション1.2のためのセクション1.1を参照）のプロトコルに従って陰窩を隔離してカウントされます。 </li><li>ゼラチン状のタンパク質混合物中の再懸濁陰窩（20μLあたり100-200陰窩）。 </li><li> 24ウェルアッセイプレートにおけるプレートのcrypt-ゼラチン状タンパク質混合懸濁液（各サンプルについて少なくとも三連であることを確認してください）とサスペンションは、CO 2、37℃で固化することができますインキュベーター。その後500μlの完全な培養培地を追加します。 </li><li>文化陰窩（ セクション1.1で説明したように）と陰窩は完全に開発オルガノイドへと成長するまで、顕微鏡下で観察する。 </li></ol></li><li>細胞外フラックスアッセイ： <ol><li>一晩非CO 2水和物カートリッジ（0％CO 2）、37℃のインキュベーター。 </li><li>培地を除去し、500μlのDMEMで二回オルガノイドを洗浄（なし：グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム及び重炭酸ナトリウム;及び付き：フェノールレッド）。 5分待ちます。 </li><li>各ウェルにウェルのアッセイ培地（2 mM L-グルタミンおよび5mM D-グルコースを含むDMEM）あたり675μlを添加する。 </li><li>オルガノイドとゼラチン状のタンパク質混合物は、洗浄の後に無傷であることを確実にするために、陰窩オルガノイド微視的形態を確認してください。非CO 2、37℃のインキュベーター内で1時間インキュベートする。 </li><li> 10μMの注射可能な化合物（オリゴマイシン、カルボニルシアニド-Pトリフルオロメトキシフェニル - ヒドラゾン（FCCP）を準備し、Rotenone）アッセイ培地中。 </li><li>セットアップカートリッジをカートリッジ順次ポートに10μMの75μlの注入可能な化合物をロードすることによって：ポートA - オリゴマイシン。ポートB - FCCP。そしてポートC - ロテノン（アッセイ中の最終濃度は、1μMとなります）。 </li><li>カートリッジ30分間インキュベートする- 37℃で1時間、非CO 2インキュベーター中。 </li><li>同時に、XFア​​ナライザをオンにし、アッセイプロトコルテンプレートを作成します。 </li><li> XFアナライザーにカートリッジとユーティリティプレートを置き、カートリッジを「キャリブレーション」を実行します。 </li><li>彼らはゼラチン状のタンパク質混合物に添付されていることを確認するために顕微鏡的に陰窩オルガノイドを確認してください。 </li><li>計器および実行アッセイプロトコルにロード細胞培養プレート。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li><li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer.">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells.">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li><li>Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells.">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC.">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7 (2013).</li><li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+changes+in+histone+modifications,+mRNA+levels,+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832/13+&#946;-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity.">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 &#946;-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li><li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro.">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li></ol>

全く開示はありません。

我々は、カルボニルシアニド、基礎速度の測定後、陰窩代謝オリゴマイシンを添加することにより評価した。ex vivoで 8ヶ月齢のマウスから単離した陰窩の酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化率（ECAR）を試験し、オルガノイドに成長順次-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）およびロテノン、。 29分（ 図2Aおよび2B） - OCR基底および基底ECAR ...

結腸直腸癌（CRC）は、米国における癌関連死亡原因の第3位である。それが人生の後半で生じたすなわち （&gt; 50歳）と、明確な素因遺伝因子を持つ- -散発大腸癌強く、長期的食事パターン1,2の影響を受けて発生率が全症例の〜80％ ​​を占め、。これらの腫瘍は、腫瘍細胞増殖3-5の高率を可能にし、おそらく駆動するために部分的に（グルタミノリシスを介して）利用可能な細胞のビルディングブロックとエネルギーのより高い濃度を行うことがワールブルク効果として知られている酸化的解糖への依存性に向けた代謝シフトを呈する。小腸癌を含む大腸癌の研究、ならびに他の胃腸癌は、腫瘍形成の原因に重要な洞察を提供する。 DETのを支援することができる胃腸器官系の、通常のプロ腫瘍形成及び腫瘍形成状態間の代謝の違いを調査腫瘍発生の相対リスクだけでなく、新生物の早期発見のermination。また、ミトコンドリア呼吸と解糖が関与する生体エネルギー代謝を理解することは、細胞生理学、老化や病気の状態が腸の恒常性を乱す方法に根本的な洞察を提供します。細胞外フラックス解析のための生体エネルギーアッセイ技術の利用は、リアルタイムで6,7、培養中で増殖する細胞で同時にミトコンドリアの呼吸と解糖の速度を評価することができます。 最近まで、小腸のin vitro試験で 8,9良性または悪性のいずれかの腫瘍由来の細胞株に限定されていましたし、正常な腸上皮の生理学および、それらが存在する微小環境の影響を表すものではありませんでした。 2009年には、佐藤らは 、10は、3次元（3D）マウス腸管上皮オルガノイド、またはepithを成長させるex vivoで培養システムを導入、実験的な診断および治療 ​​の研究10,11に適しelial「ミニ根性」、。また、カロリー制限されたマウスから単離された陰窩は、このような培養物12におけるオルガノイドとしての改変された成長特性を維持する。形質転換細胞株と比較して、陰窩オルガノイド培養物は、 インビボでの状態を理解することがはるかに優れたモデルを提示し、生理学的に関連するデータを生成するために使用することができる。 我々は、腸陰窩オルガノイドのエネルギー代謝をアッセイするために生体エネルギー分析技術に適合。マウス腸の陰窩オルガノイドは、提示さ陰窩オルガノイドエネルギー代謝研究を開発するためにex vivoで培養した。陰窩オルガノイドの酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化率（ECAR）の非存在下および存在下つの異なる代謝阻害剤（オリゴマイシン、ロテノン）のイオンキャリア（カルボニルシアニド-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン）で測定した。陰窩orgaがこれらの化学化合物へのNOID代謝反応が正常に変化ECARとOCRの値を通して反映された。 セルラー生体エネルギー研究は、癌、肥満、糖尿病、代謝性疾患およびミトコンドリア病で代謝状態および疾患リスクと表現型の間の相互の相互作用を解明および翻訳医学のための直接的な意味合いを持つ事前スクリーニング方法を助ける。ここでは、小腸陰窩を分離し、培養陰窩オルガノイドにするための詳細なプロトコルを記述します。また、我々は、代謝アッセイのためのcryptオルガノイドの文化を使用するための新規な方法をご紹介します。

<table><tbody><tr><td>BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;prime;s Modified Eagle&amp;prime;s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - &lt;strong&gt;step 2.2.2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Final concentration 1x or 2x</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin, liquid</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; GlutaMAX&amp;trade; supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Final concentration 10 mM</td></tr><tr><td>N-acetyl-L-cysteine, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Final concentration 1 mM</td></tr><tr><td>100x N-2 supplement, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&amp;reg; supplement minus Vitamin A, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 &amp;mu;g</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Final concentration 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Murine EGF, 100 &amp;mu;g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Final concentration 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Murine Noggin, 20 &amp;mu;g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Final concentration 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; L-glutamine, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Final concentration 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; glucose powder</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>Final concentration 5 mM</td></tr><tr><td>Ambion&amp;reg; 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>Final concentration 3 mM for &lt;strong&gt;step 1.1.5&lt;/strong&gt;; 2 mM for &lt;strong&gt;step 1.1.8&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DTT (dithiothreitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Final concentration 3 mM</td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0.1% in PBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1% in PBS</td></tr><tr><td>Recovery&amp;trade; Cell Culture Freezing Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Final concentration 10 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Final concentration 0.1 N in PBS</td></tr><tr><td>XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures

腸管腔に突出し、絨毛および成熟した腸細胞、杯細胞および腸内分泌細胞から成る;小腸粘膜は、2つの基本的な構造に編成され、繰り返しのアーキテクチャを示し、及び陰窩、粘膜下層および筋の近位に常駐成体幹細胞および前駆細胞を保有し、パネート細胞成熟、ならびに間質および陰微小環境の免疫細胞。ここ数年までは、小腸のin vitro試験で 、良性または悪性のいずれかで腫瘍に由来する細胞株に限定されていた、と正常な腸上皮の生理学および、それらが存在する微小環境の影響を表すものではありませんでした。ここでは、佐藤らから適応する方法を実証している。（2009）C57BL / 6マウス由来の初代マウス腸陰窩オルガノイドを培養する。さらに、メジャーによってリアルタイムに陰窩代謝プロファイルをアッセイする陰窩オルガノイド培養物の使用を提供する基礎酸素消費、解糖率、ATP産生および呼吸容量のメント。オルガノイドは、それらのソースで定義された特性を維持し、酸素消費量と細胞外酸性化率で反射されたそれらの代謝適応の側面を保持している。この陰窩オルガノイド培養系におけるリアルタイム代謝研究は、陰窩オルガノイドエネルギー代謝を研究するための強力なツールであり、それは、栄養および薬理学的因子によって調節することができる方法。

墓所オルガノイドは、8ヶ月齢のC57BL / 6マウスから樹立し、栄養76A（AIN76A）の齧歯類ダイエットアメリカの協会で精製供給した。腸の陰窩オルガノイドは、単一のcrypt（ 図1A、シングル赤矢印）から長期間培養で増殖させることができる。オルガノイド培養物（ 図1B、赤い矢印）で18-20日で暗号のような構造を成長させる。陰窩は3週間毎に継代し、オルガノイドを効率...

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Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

小腸の陰窩オルガノイド培養ex vivoで幹細胞およびそれらのニッチに依存する陰窩の成長を再現する組織培養系を提供する。私たちは、初代マウス陰窩オルガノイドリアルタイムで代謝プロフィールをアッセイする方法を確立した。私たちは、オルガノイドは、それらのソースで定義された生理学的特性を維持した。

における代謝プロファイルのリアルタイム分析<em&gt;エクスビボ</em&gt;マウス腸陰窩オルガノイド培養

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

16.2K ビュー.  Albert Einstein College of Medicine. 小腸の陰窩オルガノイド培養ex vivoで幹細胞およびそれらのニッチに依存する陰窩の成長を再現する組織培養系を提供する。私たちは、初代マウス陰窩オルガノイドリアルタイムで代謝プロフィールをアッセイする方法を確立した。私たちは、オルガノイドは、それらのソースで定義された生理学的特性を維持した。 

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Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

凍結断面化のための磁気ナノ粒子転写ウイルスベクターを用いた一次マウス腸オルガノイドの遺伝子工学

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

発生生物学

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

がん研究

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ザ<em&gt; ex vivoで</emマウス腸オルガノイドの&gt;文化とパターン認識受容体刺激

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

免疫・感染学

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

宿主-微生物叢相互作用を解析するための腸腸器官培養システム

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染のビデオプロトコル

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

生物学

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

腸内細胞増殖細胞および死細胞の定量化

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in response to infection or injury at the mucosal level as they are involved in antimicrobial responses and wound healing. They are also critical secondary messengers, regulating several pathways, including cell growth and differentiation. On the other hand, excessive ROS levels lead to oxidative stress, which can be deleterious for cells and favor intestinal diseases like chronic inflammation or cancer. This work provides a straightforward method to detect ROS in the intestinal murine organoids by live imaging and flow cytometry, using a commercially available fluorogenic probe. Here the protocol describes assaying the effect of compounds that modulate the redox balance in intestinal organoids and detect ROS levels in specific intestinal cell types, exemplified here by the analysis of the intestinal stem cells genetically labeled with GFP. This protocol may be used with other fluorescent probes.

The present protocol describes a method to detect reactive oxygen species (ROS) in the intestinal murine organoids using qualitative imaging and quantitative cytometry assays. This work can be potentially extended to other fluorescent probes to test the effect of selected compounds on ROS.

活性酸素種感受性蛍光発生プローブを用いたマウス腸管オルガノイドの酸化ストレス解析

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

マウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

著者スポットライト:オルガノイド研究のためのマウス腸管陰窩からのオルガノイドと単一幹細胞の3D培養  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

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凍結断面化のための磁気ナノ粒子転写ウイルスベクターを用いた一次マウス腸オルガノイドの遺伝子工学

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

ザ

宿主-微生物叢相互作用を解析するための腸腸器官培養システム

初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染のビデオプロトコル

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

腸内細胞増殖細胞および死細胞の定量化

活性酸素種感受性蛍光発生プローブを用いたマウス腸管オルガノイドの酸化ストレス解析

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養