Die Autoren danken Neil Whitehouse (WPI, Higgins Machine Shop) für seine Hilfe bei der CNC-Bearbeitung. Darüber hinaus möchten wir Adriana Hera (WPI Computing and Communications Center) für ihre Hilfe bei MATLAB-Programmierung, sowie Kate Beverage und Joseph Cotnoir (WPI Academic Technology Center) danken für die Unterstützung bei Camtasia. Sophie Burke und Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) vorgesehen zusätzliche Videomaterial. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R15 HL097332), die UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, die American Heart Association (undergraduate Forschungsstipendium an JZH) und Worcester Polytechnic Institute (Summer Undergraduate Research Fellowship an JZH und institutionelle finanziert Anschubfinanzierung für MWR).

1. Zellaussaat Formenbau Beginnen Sie mit dem Fräsen einer 1 / 2 &quot;dickes Stück aus Polycarbonat bis 15, mit rundem Boden, ringförmigen Vertiefungen mit einer Mittelsäule Durchmesser von 2 mm zu schaffen. Die gefrästen Kanäle sind 6 mm tief und 3,75 mm breit. Reinigen und trocknen Sie das Polycarbonat Schimmel entfernen Sie alle Kunststoff-Ablagerungen aus dem Mahlvorgang. Mix Polydimethylsiloxan (PDMS) bei einem Verhältnis von 10:1 (w / w) von Base zu Härter, Degas, um alle Luftblasen zu entfernen, und gießen Sie auf das Polycarbonat Form. Degas wieder entfernen Sie alle verbleibenden Blasen und Heilung in den Ofen bei 60 ° C für 4 Stunden. Einmal ausgehärtet, entfernen Sie vorsichtig die PDMS-Vorlage durch langsames Abziehen es weg von der Polycarbonat, mit Wasser und Seife waschen, und Autoklaven. Auch Autoklaven eine Lösung von zwei Prozent Agarose (w / v) gelöst in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM). Legen Sie die PDMS-Vorlage auf eine ebene Fläche und füllen mit geschmolzenem aga<html> stieg um ersten Pipettierung Agarose in jedem der Mitte nach Schimmel, und dann Pipettieren in den Raum um ihn herum. Lassen Sie die Agarose sich verfestigen (ca. 15 Minuten), dann invertieren die Form der Agarose aus dem PDMS freizugeben. Cut über Agarose aus der ganzen jede der Vertiefungen und legen Sie die Agarose Bohrungen in 12-Well-Platten. 2. Zellkultur-und Ring-Aussaat Add Zellkulturmedien (DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin) um die Außenseite der Agarose Form, ohne die Oberseite der Formen. Legen Sie die Platten in den Inkubator und es ihnen ermöglichen, für ca. 15 Minuten ausgleichen, während Sie die Zellen herzustellen. Bei 90% Konfluenz trypsinize Rattenaorta glatten Muskelzellen (rSMCs) und resuspendieren in einer Konzentration von 5x10 6 Zellen / ml. Je 100 ul Zellsuspension in jede der ringförmigen Agarose Brunnen, mit kreisenden Bewegungen, um Zellen in jede Vertiefung gelten. content &quot;&gt; Stellen Sie sicher, Inkubator Regale sind Ebene, dann die Platten in den Inkubator und ihnen erlauben, sitzen 24 Stunden lang ungestört. Exchange Medium alle zwei Tage danach durch Ansaugen der Medien aus der ganzen gut, und re-Füllung in jede Vertiefung, bis die Agarose gut ist völlig untergetaucht. 3. Tissue Ring Ernte-und Dickenmessung Am Ende der Kultur, entfernen Sie den Ring aus der Agarose Form, indem Sie ihn über den Rand des Zentrums zu posten. Legen Sie den Ring in einer kleinen Petrischale mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), in der Mitte der Probe, und erwerben Sie ein Bild mit einer digitalen Imaging-System. Verwenden Sie eine Bildanalyse-Programm für die Kantenerkennung und messen die Dicke des Rings in 4 Positionen (oben, unten, links und rechts) um seinen Umfang. Berechnen Sie die mittlere Dicke Wert (t) für jeden einzelnen Ring, und verwenden Sie diesen Wert auf die Querschnittsfläche berechnen(2π (t / 2) 2). 4. Mechanische Prüfung von Ringen Richten Sie die Zugprüfmaschine (Instron EPS 1000) in die horizontale Position. Bringen Sie eine 1N ± 1mN Wägezelle und benutzerdefinierte dünnen Draht Griffe (erstellt durch Biegen Edelstahlseile). Montieren Sie den Ring Probe auf den beiden dünnen Draht Griffe. Verlängern Sie die Griffe bis zu einem 5 mN Taralast auf die Probe aufgebracht wird. Geben Sie die Querschnittsfläche (berechnet aus Dickenmessungen) und notieren Sie die Messlänge. Pre-Zyklus der Ringe 8-mal zwischen den Taralast und 50 kPa Stress mit einer Geschwindigkeit von 10 mm / min. Nach dem achten pre-Zyklus, zum Scheitern zu ziehen bei 10 mm / min. Das Scheitern ist eine Abnahme der Kraft um 40% von einer Messung zur nächsten vermerkt. Für jeden Ring Probe messen die Zugfestigkeit (UTS) und Bruchdehnung und berechnen Sie den maximalen Tangente Modul (MTM) aus den gewonnenen Daten. 5. Tissue-Ring alssammlung zu fertigen Gewebe Rohre Benutzerdefinierte Rohrhalter aus Runde 5 cm Polycarbonat Scheiben mit rechteckigen Aussparungen (2 cm x 3 cm) bearbeitet. Drill Gewindebohrungen durch diese Scheiben zu ermöglichen zwei Halterungen miteinander verschraubt werden. Autoclave die benutzerdefinierte Gefäßhalter und dann Transfer zum Biosicherheitswerkbank und in eine leere Petrischale. Verwenden chirurgische Schere an den Enden von 1,9 mm Durchmesser Silikonschläuche in einem Winkel zur abgeschrägten Kanten zu schaffen geschnitten und anschließend autoklavieren Silikonschläuche. Während die Rohre sind autoklaviert wird, füllen eine Petrischale mit Medien. Entfernen Sie die Ringe von der Agarose Brunnen und legen Sie sie in der Petrischale mit den Medien. Ort autoklaviert Silikonschläuche in der gleichen Petrischale, um sie vor dem Gebrauch nass. Verwenden einer Pinzette, um eine abgeschrägte Ende einer Silikon-Schlauch in der Mitte einen Ring Platz und schieben Sie den Ring auf den Silikonschlauch. Wiederholen Sie die gewünschte Anzahl von rings. Schieben Sie die Ringe in Kontakt miteinander, indem Sie ihn sie nacheinander in beiden Richtungen entlang der Röhre. Diese Methode kann für Ringe nach nur einem Tag in Kultur geerntet werden. Sobald Ringe befestigt sind, richten Sie Silikonschläuche in der Polycarbonat-Halterungen ein und die beiden Teile der Halterung zusammen. Setzen Sie den Halter in eine 100 mm Petrischale und fügen 55 mL Medien. Börse Medien alle 3 Tage für die Dauer der Kultur. Zum Entfernen des Gewebes Rohre, lassen Sie die Silikonschläuche aus dem Polycarbonat Halter und Pinzette verwenden, um das Gewebe Rohre aus dem Silikon-Schlauch und in eine Petrischale mit PBS gefüllte Rutsche. 6. Repräsentative Ergebnisse: Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, aggregierte Zellen, Gewebe-Ringe mit einem inneren Durchmesser gleich dem Durchmesser der entsprechenden Form post innerhalb von 24 Stunden zu bilden. Die Kanten des Rings sind in der Regel in Erscheinung glatt und (wenn cultured auf einer ebenen Fläche), sind in der Dicke um den gesamten Umfang einheitlich. Das Gewebe Ringe sind einfach zu handhaben und kann aus ihren Brunnen für nachfolgende mechanische und histologische Analyse (siehe in Gwyther et al., 2011 8) entfernt werden. Tissue Ring Morphologie, Matrix Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften variieren je nach Anzahl und Art der Zellen ausgesät. Repräsentative Ergebnisse aus Gewebe Ringe aus unterschiedlichen Zelltypen, Aussaat Bedingungen, und die Kultur der Länge hergestellt, sind in Tabelle 1 dargestellt. Zwei mm ID Ringe von 5x10 5 rSMCs erstellt zeigten eine höhere UTS als Ringe aus unserer bisher veröffentlichten 2 mm Ringe (aus 6.6x10 5 rSMCs) erstellt. 8 Ähnlich wie bei Ratten-Zellen, humanen glatten Muskelzellen (HSMC) leicht aggregiert, um Gewebe zu bilden Ringe, die eine große Menge von Kollagen nach nur 14 Tagen in Kultur (Daten nicht gezeigt) enthalten. Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) auch aggregiert und bilden geschlossene Ringe, sondern lacked mechanische Festigkeit und brach während der ersten precycling Phasen der einachsigen Zugversuch. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td> Die Zellzahl </td><td> Dicke (mm) </td><td> Länge der Kultur (Tage) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> Bruchdehnung (mm / mm) </td></tr><tr><td> rSMC Ringe </td><td> 6 </td><td> 660.000 </td><td> 0,94 ± 0,12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0,50 ± 0,08 </td></tr><tr><td> rSMC Ringe </td><td> 4 </td><td> 500.000 </td><td> 0,53 ± 0,02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0,88 ± 0,05 </td></tr><tr><td> HSMC Ringe </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0,51 ± 0,05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0,92 ± 0,08 </td></tr><tr><td> hMSC Ringe </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0,40 ± 0,07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Tabelle zeigt die Kultur Parameter und mechanischen Eigenschaften von 2 mm Ringe aus unterschiedlichen Zelltypen, Aussaat-Konzentrationen und Kultur Dauer erzeugt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" /> Abbildung 1. (A) Schematische Darstellung des Gewebes Ring Generierung. (B) Custom Polycarbonat Form mit gefrästen ringförmigen Vertiefungen. Zentrale Poststelle Durchmesser 2 mm. (C) PDMS-Vorlage, nachdem sie weg war aus dem Polycarbonat Form geschält. (D) Aggregierte Gewebe Ring in einer Agarose-Form mit einer 2 mm post kultiviert. (E) Zwei mm Durchmesser Gewebe Ring in PBS. Maßstabsbalken = 6 mm (B, C) und 2 mm (D, E). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" /> Abbildung 2. Representative Grundstück von Spannungs-Dehnungs-Kurve produced aus einachsigen Zugversuch.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Seit kurzem besteht ein verstärktes Interesse an zell-basierte oder &quot;Gerüst-less&quot; Tissue Engineering Methoden, um einige der Einschränkungen von Gerüst-basierte Tissue Engineering Ansätze Adresse. Da cell-derived Gewebe aus Zellen bestehen und die Matrix die sie produzieren, sie von Natur aus enthalten viel höheren Zelldichten, enthalten keine körperfremden Materialien und kann vollständig aus menschlichen Zellen und Proteine ​​hergestellt werden. Gefäßprothesen aus menschlichen Zellen hergestellt werden erhebliche mechanische Festigkeit in Abwesenheit von exogenen Gerüsten (zB Berstdruck 3400 mmHg im Vergleich zu 1600 mmHg für den menschlichen Stammvenen) 12 zu erreichen. Obwohl zellbasierten Gefäßgewebe verbesserte Zelldichte und mechanischer Festigkeit, die meisten aktuellen Herstellungsverfahren (z. B. &quot;Blatt-based engineering&quot; 3,4,12 oder &quot;bioprinting&quot; 5,13) weisen erfordern umfangreiche Kultur Zeiträume (&gt; 3 Monate) oder Spezialausrüstung für 3D-Gewebe Konstruktion. Die cell-derived Gewebe Ring method hier beschriebenen ermöglicht eine schnelle zelluläre self-assembly, robuste 3D-Gewebe-Konstrukte in kurzer Zeit und ohne den Einsatz von Spezialgeräten zu bilden. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren, das wir entwickelt, um 2 mm Innendurchmesser Ratte glatten Muskulatur cell-derived Gewebe Ringe zu erstellen. Im vorliegenden Beispiel wurden Gewebeproben Ringe für 7 Tage (dann weitere 7 Tage zur Anellierung und tube formation kultiviert) kultiviert. Allerdings, 2 mm Ratte (und menschliche) glatten Muskelzellen Ringe können aus den Vertiefungen entfernt werden und sind kohäsive genug für das Handling (zB Übertragung auf Silikonschläuche) bereits einen Tag nach Zellaussaat. Darüber hinaus kann robuste Gewebe Ringe mit unterschiedlichen Innendurchmessern (2, 4 und 6 mm) mit dieser Methode durch einfache Änderung der post Durchmesser des ursprünglichen Polycarbonat Form erstellt werden. 8 Wir haben kürzlich auch die Polycarbonat-Formenbau modifiziert, um fünf 2 ermöglichen mm Aussaat Brunnen in einem einzigen Multi-Well-Agarose Kammer gegossen werden, dieverbraucht weniger PDMS und Agarose, und passt in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte (Daten nicht gezeigt). Änderungen in der post Durchmesser, die Breite der Aussaat gut, der Radius der Krümmung der abgerundeten Boden, kann die Anzahl der Aussaat Brunnen, oder die Tiefe der Aussaat Brunnen alle einfach durch Änderung der Angaben in der CAD-Datei für CNC geändert werden Bearbeitung der Polycarbonat-Form. Schließlich kann ein einziger Polycarbonat Form verwendet werden, um eine unbegrenzte Anzahl von PDMS-Vorlagen herzustellen, und jede PDMS Vorlage gereinigt werden kann, autoklaviert und wieder dutzende Male. Neben der Änderung der Größe des Gewebes Ringe haben wir Ringe aus vielen verschiedenen Zelltypen hergestellt, unter anderem: primären Ratten SMCs (Cell Applications, R354-05), primären humanen koronaren glatten Muskelzellen (Lonza, CC-2583), primäre humane Hautfibroblasten 11 (großzügige Schenkung von Dr. George Pins, WPI Abteilung für Biomedizinische Technik), Rattenlunge Fibroblasten (RFL-6, ATCC CCL-192) und mesenchymalen Stammzellen (Lonza, PT-2501). Jeder dieser Zelltypen Aggregate und Verträge rund um das Zentrum Beiträge von Gewebe Ringe bilden, obwohl die zelluläre Organisation, ECM Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften der Konstrukte variieren je nach Zelltyp. Die Aussaat Parameter für jeden Zelltyp muss empirisch auf der Grundlage der Größe der Zellen und ihre Fähigkeit zur Aggregation ermittelt werden. Während also dieses System zu schaffen, cell-derived Gewebe Ringe ist äußerst vielseitig, so kann das Protokoll müssen geringfügige Anpassungen für eine optimale Gewebsbildung mit verschiedenen Zelltypen. Tissue Ringgeometrie erleichtert das Be-und Beurteilung von Gewebe Materialeigenschaften von einachsigen Zugversuch, wie beschrieben. Es gibt auch erhebliche Präzedenzfall für die Nutzung der Blutgefäße Ringsegmente zu Gefäßkontraktion und physiologische Funktion zu messen. Vorläufige Studien deuten darauf hin, dass cell-derived Gewebe Ringe auf einem Draht Myographions Gerät zur Messung der pharmakologischen Ansprechbarkeit montiert werden undKontraktionskraft Generation (Daten nicht gezeigt). Insgesamt deutet die Fähigkeit, schnell herzustellen self-assembled Zelle Ringe für die histologische, mechanische, physiologische und biochemische Analyse ein leistungsfähiges neues Werkzeug, die nützlich sein für die Modellierung Gefäßgewebe Struktur und Funktion in Gesundheit und Krankheit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes / Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Catalog # </th></tr><tr><td> Polydimethylsiloxan (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15 bis 017-CV </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05-201 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Mediatech </td><td> 30 bis 002-CI </td></tr><tr><td> Digital Imaging-System </td><td> DVT Corporation </td><td> Modell 630 </td></tr><tr><td> Einachsige Prüfmaschine </td><td> Instron </td><td> ElectroPuls E1000 </td></tr><tr><td> Edge Detection Software </td><td> DVT Corporation </td><td> Rahmenprogramm 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering

Jedes Jahr unterziehen sich Hunderttausende von Patienten einer koronaren Bypass-Operation in den Vereinigten Staaten. 1 Etwa ein Drittel dieser Patienten haben keine geeignete autologe Spender Schiffe wegen Fortschreiten der Erkrankung oder frühere Ernte. Das Ziel der vaskulären Tissue Engineering ist es, eine geeignete Alternative Quelle für diese Bypass-Transplantate entwickeln. Darüber hinaus kann technisch Gefäßgewebe als wertvoll erweisen als lebende vaskulären Modelle auf Herz-Kreislauf Erkrankungen zu studieren. Mehrere viel versprechende Ansätze zur technischen Blutgefäßen erforscht worden sind, mit vielen neueren Studien mit Schwerpunkt auf der Entwicklung und Analyse von Zell-basierten Methoden. 2-5 Hier stellen wir eine Methode, um schnell selbst montieren Zellen in 3D-Gewebe Ringe, die in verwendet werden können vitro zu modellieren Gefäßgewebe. Um dies zu tun, sind Suspensionen von glatten Muskelzellen in Rundkolben ringförmigen Agarose Brunnen ausgesät. Die nicht-klebenden Eigenschaften der Agarose erlauben the-Zellen zu regeln, zu aggregieren und Vertrag um einen Stab in der Mitte des Brunnens zu einer zusammenhängenden Gewebe Ring bilden. 6,7 Diese Ringe können über mehrere Tage vor der Ernte für mechanische, physiologische, biochemische oder histologische Analyse kultiviert werden. Wir haben gezeigt, dass diese Zellen abgeleiteten Gewebe Ringe bei 100-500 kPa Zugfestigkeit 8, die den Wert für andere Gewebezüchtung vaskulären Konstrukte für ähnliche Laufzeiten (&lt;30 kPa) kultiviert berichtet übersteigt Ertrag. 9,10 Unsere Ergebnisse zeigen, dass stabile Zelle -derived Gefäßgewebe Ring Generation kann innerhalb kurzer Zeit erreicht werden kann, und bietet die Möglichkeit für direkte und quantitative Bewertung der Beiträge der Zellen und Zell-abgeleitete Matrix (CDM) zu Gefäßgewebe Struktur und Funktion.

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Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Dieser Artikel beschreibt eine vielseitige Methode zur cell-derived Gewebe Ringe durch zelluläre self-assembly erstellen. Glatte Muskelzellen in ringförmige Agarose Brunnen sammeln und Vertrag robust dreidimensionale (3D-) Gewebe innerhalb von 7 Tagen bilden ausgesät. Millimeter-Skala Gewebe Ringe sind förderlich für die mechanische Prüfung und dienen als Bausteine ​​für Gewebe Montage.

Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

directed-cellular-self-assembly-to-fabricate-cell-derived-tissue

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.9K Aufrufe.  Worcester Polytechnic Institute. Dieser Artikel beschreibt eine vielseitige Methode zur cell-derived Gewebe Ringe durch zelluläre self-assembly erstellen. Glatte Muskelzellen in ringförmige Agarose Brunnen sammeln und Vertrag robust dreidimensionale (3D-) Gewebe innerhalb von 7 Tagen bilden ausgesät. Millimeter-Skala Gewebe Ringe sind förderlich für die mechanische Prüfung und dienen als Bausteine ​​für Gewebe Montage.

Serie: Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the importance of 3-dimensional (3D) cellular assemblies in these fields. Artificial scaffolds have often been used to construct 3D cellular assemblies. However, the scaffolds used to construct cellular assemblies are sometimes toxic and may change the properties of the cells. Thus, it would be beneficial to establish a non-toxic method for facilitating cell-cell contact. In this paper, we introduce a novel method for constructing stable cellular assemblies by using optical tweezers with dextran. One of the advantages of this method is that it establishes stable cell-to-cell contact within a few minutes. This new method allows the construction of 3D cellular assemblies in a natural hydrophilic polymer and is expected to be useful for constructing next-generation 3D single-cell assemblies in the fields of regenerative medicine and tissue engineering.

We demonstrate a novel method for constructing a single-cell-based 3-dimensional (3D) assembly without an artificial scaffold.

Bearbeiten von lebenden Zellen, stabile zelluläre 3D-Baugruppe ohne künstlichen Gerüst zu bauen

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Forschung

Biochemie

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Biotechnik

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

Die Skalierung von Engineered Gefäßprothesen Mit 3D-gedruckte Führer und den Ring Stapelverfahren

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Controlling Electrospun Polymer Morphology for Tissue Engineering Demonstrated Using hepG2 Cell Line

Electrospinning affords researchers the opportunity to fabricate reproducible micro to nanoscale polymer fibers. The 3D fibrous architecture of electrospun polymers is regarded as a structural imitation of the extracellular matrix (ECM). Hence, electrospun fibers fabricated from biocompatible polymers have been widely investigated by tissue engineering researchers for their potential role as an artificial ECM for guiding tissue growth both in vitro and in vivo. All cells are acutely sensitive to their mechanical environment. This has been demonstrated by the discovery of multiple mechanotransduction pathways intrinsically linked to the cytoskeletal actin filaments. The cytoskeleton acts as a mechanical sensor that can direct the functionality and differentiation of the host cell depending on the stiffness and morphology of its substrate. Electrospun fibers can be tuned both in terms of fiber size and morphology to easily modulate the mechanical environment within a fibrous polymer scaffold. Here, methods for electrospinning polycaprolactone (PCL) for three distinct morphologies at two different fiber diameters are described. The morphological fiber categories consist of randomly oriented fibers, aligned fibers, and porous cryogenically spun fibers, with 1 &#181;m and 5 &#181;m diameters. The methods detailed within this study are proposed as a platform for investigating the effect of electrospun fiber architecture on tissue generation. Understanding these effects will allow researchers to optimize the mechanical properties of electrospun fibers and demonstrate the potential of this technology more thoroughly.

This method provides the means to test different polycaprolactone fiber morphologies and topographies for the purpose of tissue engineering. Small and large fibers are fabricated with random orientations, aligned orientations, and also porous cryogenically electrospun structures and used as platforms for cell culture.

Electrospinning affords researchers the opportunity to fabricate reproducible micro to nanoscale polymer fibers. The 3D fibrous architecture of ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Einfache, erschwingliche und modulare Musterung von Zellen mit DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...