Dieses Protokoll ermöglicht es den Fibroblasten, ihre eigene Umgebung unter definierten mechanischen Bedingungen aufzubauen und zu organisieren. Dies führt zu anisotropen Geweben mit Steifigkeit und Matrixzusammensetzungen, die mit der natürlichen Umgebung der Zelle vergleichbar sind. Diese Methode ermöglicht es, bis zu 48 Bedingungen parallel zu vergleichen.
Es ist flexibel in Bezug auf den verwendeten Zelltyp und die Kulturbedingungen. Durch die Verwendung von nur wenigen klar definierten Komponenten ist es zwischen den Laboren reproduzierbar. Durch die Anwendung profibrotischer Faktoren oder antifibrotischer Medikamente kann dieses Protokoll verwendet werden, um die zugrunde liegenden Prozesse und Therapien von fibrotischen Erkrankungen jeglicher Art zu untersuchen.
Alisa Degrave, eine Doktorandin aus unserem Labor, und ich werden das Verfahren demonstrieren. Zunächst die kryokonservierten Herzfibroblasten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für etwa zwei Minuten auftauen, bis das Fläschchen nur noch wenig Eis enthält. Als nächstes wird die Zellsuspension tropfenweise mit einer serologischen Pipette mit zwei Millilitern in ein geeignetes steriles Zentrifugenröhrchen mit 10 Millilitern Fibroblastenwachstumsmedium überführt.
Für eine optimale Zellentnahme spülen Sie die Kryo-Durchstechflasche mit einem Milliliter FGM ab und geben Sie sie in das Zentrifugenröhrchen. Die Zellen vorsichtig resuspendieren und in einen Zellkulturkolben überführen. Füllen Sie FGM jeden zweiten Tag für fünf Tage auf oder bis die Zellen 80% Konfluenz erreicht haben.
Nachdem Sie das Medium aus den kultivierten Zellen abgesaugt haben, waschen Sie die Zellen mit sechs Millilitern PBS und Aspirat, geben Sie dann sechs Milliliter des Zelldissoziationsreagenzes zu den Zellen und inkubieren Sie, bis die Zellablösung sichtbar ist. Neutralisieren Sie die enzymatische Aktivität, indem Sie sechs bis 12 Milliliter FGM zu den verdrängten Zellen im Zellassozienreagenz hinzufügen. Pipettieren Sie vorsichtig vier- bis achtmal mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten, und übertragen Sie die Zellen in ein frisches 50-Milliliter-Sammelröhrchen.
Überprüfen Sie die Ausbeute mit Hilfe eines automatisierten Zellzählers gemäß den Anweisungen des Herstellers und pelletieren Sie die Zellen ab. Nach der Zentrifugation den Überstand ansaugen, das Rohr streichen, um das Pellet zu entfernen, und die Zellen in FGM resuspendieren. Als nächstes belasten Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Mesh-Zellsieb, dann mit einem automatisierten Zellzähler, bewerten Sie die Zellzahl und -lebensfähigkeit durch Ausschluss des elektrischen Stroms, um zuverlässige Zellzahlen zu gewährleisten, bevor Sie mit dem künstlichen Bindegewebe oder der ECT-Vorbereitung fortfahren.
Um sich auf die EKT vorzubereiten, stellen Sie die Zellsuspension auf die 8,9 Millionen Zellen pro Milliliter bei 20 bis 25 Grad Celsius durch Zugabe von FGM ein und halten Sie die Zellen auf Eis. Alle anderen Röhrchen, die die einzelnen Komponenten der ECT-Hydrogelmischung enthalten, auf Eis geben und ein leeres 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vorkühlen, um die Mischung herzustellen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der ECT-Hydrogelmischung, indem Sie die im Text beschriebenen Komponenten in das vorgekühlte 50-Milliliter-Zentrifugenrohr geben, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
Zunächst wird das säurelösliche Kollagen-Typ-I-Hydrogel in eine serologische Pipette mit breiter Bohrungsspitze pipettiert. Stellen Sie den Salzgehalt der Kollagenlösung ein, indem Sie das DMEM hinzufügen, während Sie das Röhrchen für das richtige Mischen vorsichtig schwenken. Um den pH-Wert zu neutralisieren, fügen Sie 0,2 molares Natriumhydroxid hinzu, während Sie das Röhrchen schwenken, und bestätigen Sie die Neutralisation, indem Sie die rote Farbe des phenolroten Indikators beobachten.
Dann fügen Sie die Zellsuspension tropfenweise hinzu, während Sie das Röhrchen vorsichtig schwenken. Mischen Sie die Suspension, indem Sie nur einmal mit einer serologischen Pipette mit einer breiten Bohrungsspitze vorsichtig auf und ab spritzen, um Blasenbildung zu vermeiden und die Scherspannung zu minimieren. Schwenken Sie das Röhrchen 10 Mal für ein gründliches Mischen vorsichtig.
Bewahren Sie das Zentrifugenröhrchen, das die ECT-Hydrogelmischung enthält, während des gesamten Gießprozesses auf Eis auf. Befeuchten Sie eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze in einer ECT-Hydrogelmischung und verteilen Sie dann 180 Mikroliter Hydrogelmischung gleichmäßig in jede Form der 48-Well-Gießplatte, um übermäßige Scherkräfte zu vermeiden, die die Integrität der Kollagenmatrixanordnung beeinträchtigen können, und sicherzustellen, dass die gesamte Platte in 15 bis 20 Minuten fertig ist. Stellen Sie sicher, dass sich eine vollständige Schleife innerhalb der Form bildet, da eine diskontinuierliche Verteilung der ECT-Mischung eine vollständige ECT-Ringbildung verhindert.
Vermeiden Sie das Pipettieren in den inneren Brunnen und das Bilden von Blasen während des Pipettierens, um einen gleichmäßigen ECT-Hydrogelguss für eine homogene und funktionelle Gewebebildung zu gewährleisten. Legen Sie die 48-Well-Gießplatte vorsichtig in den Zellkultur-Inkubator, um die ECT-Hydrogelmischung für 15 bis 30 Minuten zu rekonstituieren. Nach der Inkubation erscheint es gelartig und undurchsichtig.
Fügen Sie 600 Mikroliter mit 37 Grad Celsius warmem FGM pro Vertiefung entlang der Wand vorsichtig hinzu, um eine ECT-Ablösung von unten zu vermeiden. Ersetzen Sie das Medium jeden Tag durch 500 Mikroliter FGM bis zur Analyse. Verwenden Sie zu den gewünschten Zeitpunkten ein Stereomikroskop, um mikroskopische Bilder der Ober- und Seitenansicht des ECT aufzunehmen.
Verwenden Sie ein Bildverarbeitungsprogramm, um eine Zeilenscananalyse durchzuführen. Legen Sie eine Skala fest und verwenden Sie das Geradelinienwerkzeug, um die ECT-Durchmesser an mindestens sechs Positionen pro Arm in jeder Bildgebungsebene zu verfolgen und zu messen. Stellen Sie die 48-Well-Gießplatte unter einem Aufnahmegerät mit einer integrierten Flächenkamera in festem Abstand vor, die mit einem hochauflösenden monochromen Bildsensor und einer UV-nahen Lichtquelle ausgestattet ist.
Führen Sie eine automatisierte Erkennung der Polspitzen durch, die Fluoreszenzfarbstoff enthalten, um den Kontrast zu maximieren. Messen Sie den Abstand zwischen den Polen von den täglichen Aufzeichnungen mithilfe einer automatisierten Analyse, indem Sie die aufgezeichneten Bilder auf einer Software ausführen, um kontrastreiche helle Pixel auf einem dunklen Hintergrund oder einem Bildverarbeitungsprogramm zu erkennen. Entfernen Sie den ECT von den Haltestangen, und setzen Sie einen Übertragungshaken und eine ECT-Schlaufe ein.
Übertragen Sie dann die ECT auf zwei Haken, die an den stationären Arm und den Wandlerarm eines extensionalen dynamischen mechanischen Riometers geklemmt sind, das mit einem 37 Grad Celsius temperierten Organbad ausgestattet ist, das mit PBS gefüllt ist. Wenden Sie die einachsige Spannung mit einer konstanten linearen Rate an, indem Sie das Riometer auf etwa 1% des Anfangsabstands zwischen den Haken pro Sekunde einstellen. Eine konstante Dehnungsrate von 0,03 Millimetern pro Sekunde kann mit typischen ECT-Abmessungen verwendet werden.
Reißen Sie die Kraft des Wandlers und leiten Sie die Dehnung ein. Halten Sie die Aufzeichnung bis zum Zeitpunkt des EKT-Bruchs nach Normalisierung der gemessenen Kraft nach Querschnittsfläche und zeichnen Sie die Spannungs-Dehnungs-Kurve unter Bestimmung verschiedener biomechanischer Parameter auf. Kurz bevor das Gewebe mit dem Mikrofrakturieren beginnt, entspricht die obere Grenze der elastischen Region der Streckgrenze und ihre Belastung ist ein Maß für die Gewebeelastizität.
Der Kunststoffbereich liegt zwischen der Streckgrenze und der Versagensstelle. Der Versagenspunkt entspricht einem plötzlichen Abfall der Spannung aufgrund eines Bruchs des Gewebes und definiert die endgültige Belastung, die ein Maß für die Dehnbarkeit des Gewebes ist. Der dritte Messpunkt entspricht der maximalen Festigkeit, die durch die höchste Belastung definiert wird, die das Gewebe tragen kann, ohne während der Dehnung zu brechen.
Die Belastbarkeit und Zähigkeit, die durch die Fläche unter der Kurve gegeben ist, entspricht der Energie, die das Gewebe bis zur Streckgrenze bzw. zum Versagenspunkt absorbiert. Für jede erhaltene Kurve entspricht die Steigung des linearen Teils des elastischen Bereichs dem Elastizitätsmodul von Young, auch Elastizitätsmodul genannt. Es ist eine mechanische Eigenschaft, die die Steifigkeit des Gewebes misst.
Unter Verwendung dieses Protokolls erfolgte die ECT-Verdichtung und -Kontraktion unter Kontrollbedingungen und in Gegenwart von FCS einige Stunden nach dem Gießen und nahm bis zum fünften Tag deutlich zu. Wenn ECT mit dem Aktinpolymerisationsinhibitor Latrunculin A behandelt wurde, war die ECT-Verdichtung reduziert, wie durch die signifikant höhere Querschnittsfläche im Vergleich zur Kontrolle angezeigt. Die Kontraktion der Gewebe wurde während der fünf Tage der Kultur beurteilt.
In Abwesenheit von Latrunculin A nahm die Kontraktion bis zum fünften Tag allmählich zu und erreichte eine Kontraktion von etwa 40%. Die Anwesenheit von Latrunculin A beeinflusste jedoch die Gewebekontraktion, was zu einer maximalen Kontraktion von nur etwa 20% führte. Die Hemmung der Aktinpolymerisation führte zu einer signifikanten Reduktion der Gewebesteifigkeit um etwa 50% über die Kontrolle.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktin-Zytoskelettintegrität für die Verdichtung, Kontraktion und Versteifung der EKT unerlässlich ist. Es ist wichtig, eine zuverlässige, qualitativ hochwertige Kollagenlösung auszuwählen und sicherzustellen, dass eine Einzelzellsuspension mit hoher Lebensfähigkeit verwendet wird, um künstliches Bindegewebe zu rekonstituieren.
