המחברים מודים בתודה ניל Whitehouse (WPI, חנות היגינס Machine) על עזרתו עם מכונות CNC. בנוסף, אנו רוצים להודות אדריאנה הרה (WPI מחשוב ותקשורת מרכז) על עזרתה עם MATLAB תכנות, כמו גם קייט ומשקאות ויוסף Cotnoir (WPI האקדמית Technology Center) לקבלת סיוע עם Camtasia. סופי בורק Jacleen בקר (WPI האקדמית Technology Center) סיפקה קטעי וידאו משלים. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לבריאות (R15 HL097332), את בית הספר לרפואה UMass-WPI מחקר פיילוט יוזמת, איגוד הלב האמריקאי (מלגת מחקר לתואר ראשון JZH), ואת המכון הפוליטכני וורצ&#39;סטר (מחקר לתואר ראשון קיץ לידידות JZH ומוסדיים סטארט כספים MWR).

1. זריעת Cell עובש ייצור בגין על ידי כרסום 1 / 2 &quot;חתיכה עבה של פוליקרבונט כדי ליצור 15, תחתית עגולה, בארות טבעתי בקוטר מרכז שלאחר מ&quot;מ 2. ערוצי הסתובבו הם 6 מ&quot;מ עמוקה 3.75 מ&quot;מ רחב. נקי ויבש את התבנית כדי פוליקרבונט להסיר את כל פסולת הפלסטיק תהליך הטחינה. מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) בשעה 10:01 יחס (w / w) בסיס לסוכן ריפוי, דגה כדי להסיר את כל בועות האוויר, ויוצקים על התבנית פוליקרבונט. דגה שוב כדי להסיר בועות הנותרים, ולרפא בתנור על 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. נרפא פעם, להסיר בזהירות את התבנית על ידי PDMS לאט לקלף אותה הרחק פוליקרבונט, לשטוף עם סבון ומים, החיטוי. כמו כן החיטוי פתרון של שתי אחוזים agarose (w / v) מומס שונה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM). מניחים את התבנית PDMS על משטח ישר ומלא עם האגא מותך<html> עלה על ידי הראשון pipetting agarose לתוך כל אחד תבניות הודעה המרכז, ולאחר מכן pipetting לחלל סביבו. אפשר agarose כדי לבסס (כ 15 דקות), ואז להפוך את התבנית כדי לשחרר את agarose מן PDMS. גזור agarose עודף סביב כל אחת הבארות, והמקום בארות לתוך 12-agarose גם הצלחות. 2. Cell תרבות זריעת טבעת הוסף תרבית תאים מדיה (DMEM עם 10% ו -1% FBS פניצילין, סטרפטומיצין) סביב החלק החיצוני של התבנית agarose, ללא מכסה את החלק העליון של תבניות. מקמי את הצלחות בחממה ולאפשר להם לאזן במשך כ 15 דקות תוך כדי להכין את התאים. באותו מפגש 90%, trypsinize אבי העורקים חולדה חלקה שריר תאים (rSMCs) ו resuspend בריכוז של 5x10 6 תאים / מ&quot;ל. פיפטה 100 μL ההשעיה לתוך תא אחד טבעתי agarose בארות, בתנועות מעגליות כדי להחיל התאים היטב כל אחד. תוכן &quot;&gt; ודא המדפים חממה הן ברמה, אז במקום צלחות בחממה ולאפשר להם לשבת באין מפריע במשך 24 שעות. מדיום חליפין כל יומיים לאחר מכן על ידי aspirating התקשורת מרחבי היטב, מילוי מחדש כל טוב עד agarose גם הוא שקוע לגמרי. 3. טבעת רקמה קציר ומדידות עובי בסיומו של תרבות, להסיר את הטבעת עובש agarose ידי הזזה זה מעל לפרסם את המרכז. מניחים את הטבעת בצלחת פטרי קטנה עם פוספט בופר סליין (PBS), במרכז המדגם, לרכוש תמונה באמצעות מערכת ההדמיה הדיגיטלית. השתמש ניתוח התמונה בתוכנית לאיתור קצה ולמדוד את עובי הטבעת ב 4 עמדות (למעלה, למטה, ימינה ושמאלה) סביב היקפו. חשב את ערך עובי ממוצע (t) עבור כל טבעת הפרט, להשתמש כדי לחשב את ערך שטח חתך(2π (t / 2) 2). 4. בדיקה מכנית של טבעות הגדרת מכונה בדיקות מתיחה (Instron EPS 1000) במצב אופקי. צרף תא 1N ± 1mN לטעון אישית אוחז חוט דק (שנוצר על ידי כיפוף חוט נירוסטה). הר מדגם הטבעת על שני אוחזת חוט דק. הרחבת להתמודד עד עומס 5 mn טרה מוחל על המדגם. הזן את שטח חתך (מחושבים ממדידות עובי) ולהקליט את אורך מד. טרום מחזור טבעות 8 פעמים בין לטעון את טרה ו 50 מתח kPa בשיעור של 10 מ&quot;מ / דקה. לאחר השמיני טרום מחזור, למשוך לכישלון של 10 מ&quot;מ / דקה. כישלון הוא כאמור ירידה בכוח על ידי 40% מן מדידה אחד למשנהו. עבור כל דגימה טבעת, למדוד את הלחץ מתיחה האולטימטיבי (UTS) ומתח כישלון לחשב את המקסימום משיק מודולוס (MTM) מהנתונים רכשה. 5. רקמות כמו טבעתsembly לפברק צינורות רקמה מחזיקי צינור מותאמות אישית במכונה מסיבוב 5 דיסקים ס&quot;מ פוליקרבונט עם מגזרות מלבני (2 ס&quot;מ X 3 ס&quot;מ). לקדוח חורים מושחל דרך דיסקים אלה לאפשר לשני בעלי להידפק יחד. החיטוי בעלי שפופרת אישית, ולאחר מכן להעביר לממשלה biosafety ומניחים צלחת פטרי ריקות. השתמש במספריים כירורגית לחתוך את הקצוות של 1.9 מ&quot;מ קוטר צינורות סיליקון בזווית כדי ליצור שוליים משופעים, ולאחר מכן החיטוי צינורות סיליקון. בעוד צינורות נמצאים autoclaved, למלא צלחת פטרי עם התקשורת. הסר את טבעות מבארות agarose ומניחים אותם בצלחת פטרי עם התקשורת. המקום autoclaved צינורות סיליקון בצלחת פטרי אותו כדי להרטיב אותם לפני השימוש. שימוש במלקחיים למקום בסוף משופעים של שפופרת סיליקון למרכז טבעת בעדינות להחליק את הטבעת על צינורות הסיליקון. חזור עם המספר הרצוי של רימהה. החלק את טבעות במגע אחד עם השני על ידי בעדינות לדחוף אותם ברציפות בשני הכיוונים לאורך הצינור. שיטה זו יכולה לשמש עבור טבעות שנקטפו אחרי יום אחד בלבד בתרבות. ברגע טבעות מורכבים, ליישר צינורות סיליקון בתוך מחזיקי פוליקרבונט בורג שני החלקים של בעל יחד. המקום מחזיק בתוך צלחת פטרי 100 מ&quot;מ ולהוסיף 55 מ&quot;ל התקשורת. שערי המדיה כל 3 ימים למשך תרבות. כדי להסיר את צינורות רקמות, לשחרר את צינורות סיליקון מבעל פוליקרבונט להשתמש במלקחיים כדי להחליק את צינורות רקמה את צינור סיליקון לתוך צלחת פטרי מלאות PBS. 6. נציג תוצאות: כאשר פרוטוקול מבוצע כראוי, מצטבר בתאים ליצירת טבעות רקמה בקוטר פנימי שווה לקוטר של הפוסט את התבנית המתאימה בתוך 24 שעות. קצוות הטבעת הן בדרך כלל חלק במראה (אם culturעורך על משטח ישר), הם אחידים בעובי סביב ההיקף כולו. הטבעות רקמה קל לטפל ניתן להסיר מבארות שלהם לניתוח מכני היסטולוגית לאחר מכן (ראה ב Gwyther et al. 2011 8). טבעת רקמה מורפולוגיה, הרכב מטריצה, תכונות מכניות להשתנות בהתאם למספר וסוג של תאים שנזרעו. תוצאות נציגת טבעות רקמה עשוי סוגי תאים שונים, זריעת התנאים, אורך תרבות מוצגים בלוח 1. שתי טבעות זהות מ&quot;מ שנוצרו 5x10 5 rSMCs הציג UTS גבוה יותר מאשר טבעות שנוצרו שפורסמו בעבר שלנו 2 טבעות מ&quot;מ (עשוי 6.6x10 5 rSMCs). 8 דומים לתאי עכברוש, אדם לתאי שריר חלק (hSMC) בקלות מצטברים כדי ליצור רקמות טבעות, שהכיל כמות גדולה של קולגן רק לאחר 14 ימים בתרבות (מידע לא מוצג). אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSC) מצטברים גם ויצרו טבעות מלוכדת, אך להחוזק מכני cked ושבר במהלך שלבי precycling הראשוני של בדיקות מתיחה uniaxial. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td> תא מספר </td><td> עובי (מ&quot;מ) </td><td> אורך של התרבות (ימים) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> אי זן (מ&quot;מ / מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> rSMC טבעות </td><td> 6 </td><td> 660000 </td><td> 0.94 ± 0.12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0.50 ± 0.08 </td></tr><tr><td> rSMC טבעות </td><td> 4 </td><td> 500000 </td><td> 0.53 ± 0.02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0.88 ± 0.05 </td></tr><tr><td> hSMC טבעות </td><td> 3 </td><td> 750000 </td><td> 0.51 ± 0.05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0.92 ± 0.08 </td></tr><tr><td> hMSC טבעות </td><td> 3 </td><td> 750000 </td><td> 0.40 ± 0.07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> טבלה 1. טבלה המציגה את הפרמטרים תרבות תכונות מכניות של 2 מ&quot;מ טבעות שנוצר סוגי תאים שונים, ריכוזי זריעה, ואת משכי תרבות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" /> באיור 1. (א) סכמטי של תהליך טבעת רקמה דור. (ב) מותאם אישית פוליקרבונט עם עובש בארות טבעתי מחורץ. בקטרים ​​הודעה המרכזית הם 2 מ&quot;מ. (ג) PDMS התבנית לאחר התקלף מן התבנית פוליקרבונט. (ד) טבעת רקמה מצטבר עובש בתרבית agarose עם הודעה של 2 מ&quot;מ. (ה) שני מ&quot;מ רקמה בקוטר הטבעת PBS. ברים סולם = 6 מ&quot;מ (B, C) ו 2 מ&quot;מ (D, E). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" /> באיור 2. העלילה נציג מתח מתח עקומת produCED מניסוי מתיחה uniaxial.

<ol>
	<li>Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2011+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li><li>Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering:+self-assembly+of+microtissue+building+blocks.">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).</li><li>Gauvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-step+self-assembly+approach+for+the+fabrication+of+tissue-engineered+vascular+constructs.">A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).</li><li>L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+blood+vessel+for+adult+arterial+revascularization.">Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).</li><li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting.">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).</li><li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods,+tori,+and+honeycombs:+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries.">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).</li><li>Livoti, C. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+and+tissue+fusion+of+toroid-shaped+minimal+building+units.">Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).</li><li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells.">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).</li><li>Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+conditioning+of+collagen-gel+blood+vessel+constructs+induces+remodeling+in+vitro.">Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro.</a> Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).</li><li>Rowe, S. L., Stegemann, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+collagen-fibrin+composite+matrices+with+varying+protein+contents+and+ratios.">Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios.</a> Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).</li><li>Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. a. n., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+triggers+rapid+contraction+and+degradation+of+fibroblast-populated+collagen+lattices.">Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices.</a> J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).</li><li>Konig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+completely+autologous+human+tissue+engineered+blood+vessels+compared+to+human+saphenous+vein+and+mammary+artery.">Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery.</a> Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).</li><li>Mironov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לאחרונה חלה התעניינות מוגברת מבוססי תאים או &quot;פיגום פחות&quot; הנדסת רקמות שיטות כדי לטפל בכמה מגבלות פיגום מבוססי גישות הנדסת רקמות. בהתחשב בכך תאים שמקורם ברקמות נוצרות בתאים המטריצה ​​שהם מייצרים, הם מטבעם מכילים הרבה יותר גבוה צפיפות התא, אינם מכילים חומרים אקסוגניים, והוא יכול להיות עשוי כולו מ תאים חלבונים אנושיים. שתלי כלי דם העשויים תאים אנושיים יכולים להשיג חוזק מכני ניכר בהעדר פיגומים חיצוניים (למשל, לחצים פרץ 3400 מ&quot;מ כספית לעומת 1600 מ&quot;מ כספית עבור ורידים saphenous אדם) 12. למרות מבוססי תאים ורקמות כלי דם התערוכה צפיפות התאים שיפור חוזק מכני, שיטות ייצור העדכניים ביותר (כגון &quot;הנדסה גיליונות מבוסס&quot; 3,4,12 או &quot;bioprinting&quot; 5,13) לדרוש תקופות תרבות ענפה (&gt; 3 חודשים) או ציוד מיוחד לבניית רקמות 3D. תאים שמקורם ברקמה טבעת ספידod המתואר כאן מאפשר מהירות הסלולר הרכבה עצמית ליצירת חזקים בונה רקמת 3D בתוך פרק זמן קצר ללא שימוש בציוד מיוחד. פרוטוקול זה מפרט את ההליך שפיתחנו כדי ליצור 2 מ&quot;מ קוטר פנימי חולדה חלקה שריר תאים שמקורם ברקמה טבעות. בדוגמה הנוכחית, הטבעות היו בתרבית רקמה במשך 7 ימים (בתרבית אז עבור 7 ימים נוספים לאיחוי טבעת היווצרות צינור). עם זאת, 2 עכברוש מ&quot;מ (אדם) וחלק תא טבעות שרירים ניתן להסיר את בארות והם מלוכדת מספיק לטיפול (למשל, על העברת צינורות סיליקון) מוקדם ככל שיום אחד לאחר זריעת התאים. בנוסף, טבעות רקמות חזקים עם קוטר פנימי משתנה (2, 4 ו 6 מ&quot;מ) ניתן ליצור בשיטה זו פשוט על ידי שינוי בקוטר הודעה של עובש פוליקרבונט המקורי. 8 אנחנו גם שונה לאחרונה את עיצוב תבנית פוליקרבונט כדי לאפשר five 2 זריעת מ&quot;מ בארות להיות יצוק יחידה רב גם agarose קאמרית, אשרמשתמשת פחות PDMS ו agarose, ומתאים באחד היטב צלחת 6-באר (מידע לא מוצג). שינויים בקוטר בהודעה, רוחב של זריעת הבאר, רדיוס העקמומיות של התחתון מעוגל, במספר בארות זריעה, או את העומק של בארות זריעת כולם יכולים להיות שונה פשוט על ידי שינוי מפרטים בקובץ ה-CAD עבור CNC עיבוד של עובש פוליקרבונט. לבסוף, עובש יחיד פוליקרבונט יכול לשמש כדי לפברק מספר בלתי מוגבל של תבניות PDMS, וכל תבנית PDMS ניתן לנקות, autoclaved ולעשות בהם שימוש חוזר עשרות פעמים. בנוסף לשינוי גודל הטבעות רקמות, עשינו טבעות מהרבה סוגי תאים שונים, כולל: SMCs עכברוש הראשי (יישומים סלולריים, R354-05), אדם יסודי SMCs לב כלילית (Lonza, CC-2583), האדם העיקרי fibroblasts עורי 11 (מתנה נדיבה של סיכות ד&quot;ר ג&#39;ורג&#39;, WPI המחלקה להנדסה ביורפואית), ריאות fibroblasts חולדה (RFL-6, ATCC CCL-192), וכן בתאי גזע mesenchymal (Lonza, PT-2501). כל אחד מסוגי אגרגטים תא חוזים סביב שנכתבו למרכז כדי ליצור טבעות רקמות; אף ארגון הסלולר, הרכב ECM, תכונות מכניות של מבנים משתנים לכל סוג תא. הפרמטרים זריעת לכל סוג תא צריכה להיקבע באופן אמפירי מבוסס על גודל התאים ואת יכולתם לצבור. לכן, בעוד המערכת של יצירת תאים שמקורם ברקמה טבעות הוא מאוד תכליתי, פרוטוקול ייתכן שיהיה צורך בהתאמות קלות להיווצרות רקמת אופטימלי עם סוגי תאים שונים. טבעת הגיאומטריה רקמה מקלה טעינת הערכה קלה של תכונות החומר על ידי בדיקת רקמות מתיחה uniaxial, כמתואר. יש גם תקדים משמעותי באמצעות כלי דם מגזרים טבעת למדוד התכווצות כלי הדם ותפקוד פיזיולוגי. מחקרים ראשוניים מצביעים על תאים שמקורם ברקמה טבעות יכול להיות מותקן על מכשיר myograph חוט למדידת היענות תרופתי ודור התכווצות כוח (מידע לא מוצג). בסך הכל, את היכולת לייצר במהירות עצמית התאספו טבעות תא לניתוח היסטולוגית, מכני, פיזיולוגי, ביוכימי ו מציע כלי חדש רב עוצמה זה עשוי להיות שימושי עבור מודלים מבנה רקמות תפקוד כלי הדם ועל בריאות ומחלה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> קטלוג # </th></tr><tr><td> Polydimethylsiloxane (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15-017-CV </td></tr><tr><td> עוברית שור סרום (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05-201 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Mediatech </td><td> 30-002-CI </td></tr><tr><td> מערכת הדמיה דיגיטלית </td><td> DVT Corporation </td><td> דגם 630 </td></tr><tr><td> בדיקות uniaxial מכונה </td><td> Instron </td><td> E1000 ElectroPuls </td></tr><tr><td> איתור Edge תוכנה </td><td> DVT Corporation </td><td> Framework 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering

בכל שנה, מאות אלפי חולים לעבור ניתוח מעקפים בעורק בארצות הברית. 1 כשליש מהחולים הללו אין כלי מתאים התורם עצמיים בשל התקדמות המחלה או הקציר הקודם. מטרתה של הנדסת רקמות כלי דם היא לפתח מקור חלופי מתאים אלה שתלי לעקוף. בנוסף, רקמת כלי דם מהונדסים עשויים להביא תועלת כמו החיים דגמים של כלי הדם כדי לחקור מחלות לב וכלי דם. מספר גישות מבטיחות לכלי הדם הנדסה נחקרו, עם מחקרים עדכניים רבים מתמקדת בפיתוח וניתוח של תא המבוססת על שיטות. 2-5 בזאת, אנו מציגים שיטה במהירות עצמית להרכיב תאים לטבעות רקמה 3D כי ניתן להשתמש במבחנה למודל רקמות כלי דם. כדי לעשות זאת, השעיות של בתאי שריר חלק הם זורעים לתוך עגול תחתית טבעתי agarose בארות. לא דבק המאפיינים של agarose לאפשר הבתאי הדואר להתיישב, המצרפי חוזה סביב לפרסם במרכז היטב כדי ליצור טבעת רקמה מלוכדת. 6,7 טבעות אלה יכולים להיות מתורבת במשך כמה ימים לפני קציר מכני עבור ניתוח, פיזיולוגית ביוכימית או היסטולוגית. הראינו כי אלה תאים שמקורם ברקמה טבעות התשואה על 100-500 כוח kPa האולטימטיבי מתיחה 8 אשר עולה על הערך דיווח על אחרים מהונדסים בונה רקמת כלי דם בתרבית לתקופות דומות (&lt;30 kPa). 9,10 התוצאות שלנו מראות כי תאים חזקים הנגזרות דור וסקולרית טבעת רקמה יכולה להיות מושגת בתוך פרק זמן קצר, והיא מציעה את ההזדמנות להערכה כמותית ישירה של תרומות של תאים תאים שמקורם מטריצה ​​(CDM) על מבנה רקמת תפקוד כלי הדם.

Watch this Scientific Journal Video about Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering at JoVE.com

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

מאמר זה מתאר שיטה צדדי כדי ליצור תאים שמקורם ברקמה טבעות על ידי הרכבה עצמית הסלולר. לתאי שריר חלק seeded לתוך בצורת טבעת המצרפי בארות agarose חוזה ליצירת חזקים תלת ממדי (3D) ברקמות בתוך 7 ימים. מילימטר בקנה מידה טבעות רקמה תורמת בדיקות מכניות לשמש כאבני בניין להרכבת רקמות.

בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק Cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

directed-cellular-self-assembly-to-fabricate-cell-derived-tissue

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.9K Views.  Worcester Polytechnic Institute. מאמר זה מתאר שיטה צדדי כדי ליצור תאים שמקורם ברקמה טבעות על ידי הרכבה עצמית הסלולר. לתאי שריר חלק seeded לתוך בצורת טבעת המצרפי בארות agarose חוזה ליצירת חזקים תלת ממדי (3D) ברקמות בתוך 7 ימים. מילימטר בקנה מידה טבעות רקמה תורמת בדיקות מכניות לשמש כאבני בניין להרכבת רקמות...

Video: Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

כמו כריך microenvironments לרתום ניידים / חומרי אינטראקציות

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

הכנת Thermoresponsive Nanostructured משטחי הנדסת רקמות

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

הנדסת רקמות ידי עצמותי כלי דם בתוך<em&gt; In vivo</em&gt; הנדסת רקמות קאמרית

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק Cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video