Yazarlar minnetle Neil Whitehouse (TEFE, Higgins Makine Atölyesi), CNC işleme ile yaptığı yardım için kabul etmiş sayılırsınız. Ayrıca, biz Camtasia yardım için MATLAB programlama yanı sıra Kate İçecek ve Joseph Cotnoir (TEFE Akademik Teknoloji Merkezi) ile ona yardım için Adriana Hera (TEFE Bilgisayar ve İletişim Merkezi) teşekkür etmek istiyorum. Sophie Burke ve Jacleen Becker (TEFE Akademik Teknoloji Merkezi) tamamlayıcı video görüntüleri sağladı. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (R15 HL097332), UMass Tıp Fakültesi-TEFE Pilot Araştırma Girişimi, Amerikan Kalp Derneği (JZH Lisans Araştırma Bursu) ve Worcester Politeknik Enstitüsü (JZH ve kurumsal Yaz Lisans Araştırma Bursu tarafından finanse edildi ) MWR fon start-up.

1. Hücre tohumlama kalıp imalat 2 mm bir merkez sonrası çapı 15, yuvarlak tabanlı, anüler kuyuları oluşturmak için polikarbonat 1 / 2 &quot;kalın parça öğütülmesi ile başlayın. Öğütülmüş kanal 6 derin mm ve 3,75 mm geniş. Temizlik ve polikarbonat kalıp kuru. öğütme işlemi herhangi bir plastik pislikleri temizleyin. Mix polidimetilsiloksan tüm hava kabarcıkları ve polikarbonat kalıp üzerine dökmek için kür ajanı, gazını tabanının 10:1 oranını (w / w) (PDMS). Degas, herhangi bir kalan kabarcıklar tekrar kaldırmak ve 60 ° C&#39;de 4 saat boyunca fırında tedavi. Kürünü polikarbonat yavaş yavaş soyma tarafından dikkatle PDMS şablonu kaldırmak, su ve sabun ile yıkayın ve otoklav. Ayrıca iki yüzde agaroz (w / v) Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle orta (DMEM) içinde çözünmüş bir çözüm otoklavda. PDMS şablonu, düz bir yüzeye yerleştirin ve erimiş aga ile doldurun.<html> merkezi yazılan kalıp her birine ilk pipetleme agaroz yükseldi ve daha sonra etrafındaki uzaya pipetleme. Agaroz (yaklaşık 15 dakika) sağlamlaştırmak için izin ver, sonra PDMS agaroz serbest kalıp ters çevirin. Kuyuların her biri dört bir yanından gelen aşırı agaroz Kes ve agaroz kuyulardan 12 kuyucuğu içine yerleştirin. 2. Hücre kültürü ve halka tohumlama Kalıp üst kapsayan, agaroz kalıp dış çevresindeki hücre kültür ortamı (% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile DMEM) ekleyin. Inkübatör tabak yerleştirin ve hücreleri hazırlamak için yaklaşık 15 dakika denge sağlaması için izin verir. % 90 izdiham, sıçan aort düz kas hücreleri (rSMCs) trypsinize ve 5x10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon tekrar süspansiyon. Anüler agaroz kuyuların her birine hücre süspansiyonu her bir kuyunun hücreleri uygulamak için bir dairesel hareket kullanarak Pipet 100 mcL. içerik &quot;&gt; emin inkübatör raflar düzeyde olduğundan emin olun, sonra inkübatör tabak yerleştirin ve onları 24 saat boyunca rahatsız edilmeden oturmak için izin Exchange orta, her iki gün sonra iyi dört bir yanından gelen medya aspire, ve yeniden doldurma her bir kuyunun kadar agaroz tamamen sular altında. 3. Doku halka toplama ve kalınlık ölçümleri Bitiminde kültür merkezi yazılan üstünden kaydırarak agaroz kalıp halka çıkarın. Fosfat ile küçük bir Petri kabındaki halka koyun salin (PBS), merkez örnek tamponlu ve bir dijital görüntüleme sistemi kullanılarak bir görüntü elde. Kenar algılama için bir görüntü analiz programı kullanın ve çevresi yaklaşık 4 pozisyonları (üst, alt, sol ve sağ) halka kalınlığı ölçmek. Her bir halka için ortalama kalınlığı (t) değeri hesaplayın ve kesit alanı hesaplamak için bu değeri kullanın(2π (t / 2) 2). 4. Yüzük Mekanik test Yatay konumda çekme test makinesi (Instron EPS 1000) ayarlayın. 1N ± 1dk yük hücresi ve özel ince tel sardı (paslanmaz çelik tel bükme tarafından oluşturulan) takın. Iki ince tel kulpları halka örnek monte edin. Kancalar 5 mN dara yükü örnek uygulanana kadar uzatın. Kesit alanı (kalınlığı ölçümleri hesaplanan) girin ve ölçü uzunluğu kaydetmek. Ön döngüsü 10 mm / dak hızında dara yükü ve 50 kPa stres arasında 8 kez çalar. Sekizinci ön döngüsü sonra, 10 mm / dak &#39;da başarısızlığa çekin. Başarısızlık,% 40 oranında bir ölçüm sonraki yürürlüğe bir azalma olduğunu kaydetti. Her bir halka örnek için, nihai çekme gerilimi (UTS) ve başarısızlık gerginlik ölçmek ve elde edilen veriler maksimum Tanjant modülü (MTM) hesaplamak. 5. Doku halka olaraksembly doku tüpler imal Özel palplanşların yuvarlak dikdörtgen kesikler (2 cm x 3 cm) 5 cm polikarbonat diskler işlenmiştir. Bu disk ile birlikte iki sahipleri vidalı izin vermek için dişli delikler delin. Özel tüp sahipleri Otoklav ve ardından biyogüvenlik kabini ve boş bir Petri kabı yerine transfer. 1.9 mm çapında silikon tüplerin uçları Eğimli kenarları oluşturmak için bir açıyla kesmek ve sonra silikon tüpler otoklavda cerrahi makas kullanın. Tüpler otoklava edilirken, medya ile bir Petri kabı doldurun. Agaroz kuyulardan halkalar çıkarın ve medya ile Petri kabı koyun. Yeri kullanmadan önce ıslak aynı Petri kabındaki silikon tüpler otoklava. Bir silikon tüp kesik ucunu, bir halkanın merkezi içine yerleştirin ve hafifçe silikon tüp üzerine halka slayt forseps kullanın. Ri, istediğiniz numarayı tekrarlayınNGS. Birbiri ile temas halkaları hafifçe tüp boyunca her iki yönde de gittikçe onları iterek kaydırın. Bu yöntem, kültür sadece bir gün sonra hasat halkaları için kullanılabilir. Bir kez yüzük polikarbonat sahipleri içinde silikon tüpler hizalamak ve sahibinin iki parça birbirine vida monte edilir. 100 mm Petri kabındaki sahibi yerleştirin ve 55 ml medya ekleyebilirsiniz. Exchange medya her kültür süresi 3 gün. Doku tüpleri kaldırmak için, polikarbonat sahibinden silikon tüpler bırakın ve silikon tüp kapalı ve PBS ile dolu bir Petri kabı içine doku tüpleri slayt forseps kullanmak. 6. Temsilcisi Sonuçlar: Protokolü doğru yapıldığında, hücrelerin iç çapı ile ilgili kalıp sonrası 24 saat içinde çapına eşit bir doku halkaları oluşturmak için agrega. Halka kenarlar genellikle görünüş olarak düzgün ve (eğer kültüred), düz bir yüzey üzerinde tüm çevresi kalınlığı tekdüze. Doku çaldığında kolay ve daha sonraki mekanik ve histolojik analiz için kuyu (Gwyther et al, 2011 8) çıkarılabilir. Doku halka morfoloji, matris kompozisyon ve mekanik özellikler numaralı seribaşı hücrelerinin sayısı ve türüne göre değişir. , Hücre tipleri, değişen koşulları tohumlama ve kültür süresini doku halkaları Temsilcisi sonuçlar Tablo 1&#39;de gösterilmiştir. 5x10 5 rSMCs oluşturulan iki mm ID halkaları, bizim daha önce yayınlanmış 2 mm halkalar (6.6x10 5 rSMCs yapılan) oluşturulmuş bir yüzük daha yüksek UTS sergiledi. Sıçan hücreleri, insan düz kas hücreleri (HSMC) 8 kolayca doku oluşturmak için toplanmış kültürde sadece 14 gün (veriler gösterilmemiştir) sonra büyük miktarda kolajen içeren halkaları. İnsan mezenkimal kök hücreler (hMSC) toplanmış ve birbirine bağlı halkalar oluşmuş, ancak lacked mekanik dayanımı ve tek eksenli çekme testi ilk precycling aşamalarında kırdı. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td> Hücre sayısı </td><td> Kalınlığı (mm) </td><td> Kültür uzunluğu (gün) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> Arıza suşu (mm / mm) </td></tr><tr><td> rSMC halkaları </td><td> 6 </td><td> 660.000 </td><td> 0.94 ± 0.12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0.50 ± 0.08 </td></tr><tr><td> rSMC halkaları </td><td> 4 </td><td> 500.000 </td><td> 0.53 ± 0.02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0.88 ± 0.05 </td></tr><tr><td> HSMC halkaları </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0.51 ± 0.05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0.92 ± 0.08 </td></tr><tr><td> hMSC halkaları </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0.40 ± 0.07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Kültür parametreleri ve farklı hücre tipleri, tohum konsantrasyonları, ve kültür süreleri üretilen 2 mm halkaları mekanik özelliklerini gösteren tablo. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" /> Şekil 1 (A) doku halka oluşturma süreci şematik. (B) Özel öğütülmüş anüler kuyuları ile polikarbonat kalıp. Merkez yazılan çapları 2 mm. (C) polikarbonat kalıp uzak soyuldu sonra PDMS şablon. (D) Toplulaştırılmış doku halkası, 2 mm bir yazı ile bir agaroz kalıp kültür. PBS içinde (E) İki mm çapında doku halkası. Ölçek bar = 6 mm (B, C) ve 2 mm (D, E). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" /> Şekil 2 gerilme-şekil değiştirme eğrisi süreden Temsilcisi arsatek eksenli çekme testi CED.

<ol>
	<li>Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2011+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li><li>Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering:+self-assembly+of+microtissue+building+blocks.">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).</li><li>Gauvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-step+self-assembly+approach+for+the+fabrication+of+tissue-engineered+vascular+constructs.">A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).</li><li>L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+blood+vessel+for+adult+arterial+revascularization.">Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).</li><li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting.">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).</li><li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods,+tori,+and+honeycombs:+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries.">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).</li><li>Livoti, C. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+and+tissue+fusion+of+toroid-shaped+minimal+building+units.">Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).</li><li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells.">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).</li><li>Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+conditioning+of+collagen-gel+blood+vessel+constructs+induces+remodeling+in+vitro.">Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro.</a> Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).</li><li>Rowe, S. L., Stegemann, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+collagen-fibrin+composite+matrices+with+varying+protein+contents+and+ratios.">Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios.</a> Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).</li><li>Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. a. n., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+triggers+rapid+contraction+and+degradation+of+fibroblast-populated+collagen+lattices.">Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices.</a> J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).</li><li>Konig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+completely+autologous+human+tissue+engineered+blood+vessels+compared+to+human+saphenous+vein+and+mammary+artery.">Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery.</a> Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).</li><li>Mironov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Son zamanlarda, hücre tabanlı veya &quot;iskele-az&quot; doku mühendisliği yöntemleri iskele tabanlı doku mühendisliği yaklaşımları bazı sınırlamaları adresi artan bir ilgi olmuştur. Hücre kökenli dokuların hücreleri oluşturulur ve ürettikleri matrisi, onlar doğal olarak çok daha fazla hücre yoğunlukları içeren herhangi bir eksojen maddeler içermez ve tamamen insan hücreleri ve protein yapılabilir olduğunu verilmiştir. Vasküler greftler insan hücrelerinde yapılan eksojen iskeleleri olmaması (örneğin, patlama basınçları insan safen venler için 1600 mmHg göre 3400 mmHg) 12 önemli mekanik gücü elde edebilirsiniz. Vasküler dokularda hücre tabanlı gelişmiş hücre yoğunluğu ve mekanik dayanım, en güncel imalat yöntemleri (&quot;sac-bazlı mühendislik&quot; 3,4,12 veya &quot;bioprinting&quot; 5,13 gibi) gösterir rağmen geniş kültürünün bir süre (&gt; 3 ay) gerektiren veya 3D doku yapımı için özel ekipman. Hücre kökenli doku halka method Burada anlatılan kısa bir süre içinde ve özel ekipman kullanımı olmadan sağlam bir 3D doku yapıları oluşturmak için hızlı hücresel kendini montaj sağlar. Bu protokol, 2 mm iç çapı sıçan düz kas hücre kaynaklı doku halkaları oluşturmak için geliştirilen prosedürü. Bu örnekte, doku yüzük 7 gün için (daha sonra halka füzyon ve tüp oluşumu için ek bir 7 gün süreyle kültüre) kültüre edildi. Ancak, bir gün sonra hücre tohumlama gibi erken 2 mm sıçan (insan), düz kas hücre halkaları kuyulardan kaldırılır ve (örneğin, silikon tüpler üzerine, transfer) kullanım için yeteri kadar güçlü olabilir. Buna ek olarak, sadece orijinal polikarbonat kalıp sonrası çapı değiştirerek, değişen iç çaplarda (2, 4 ve 6 mm) ile sağlam doku halkalar bu yöntem ile oluşturulabilir. 8 Ayrıca, son beş 2 etkinleştirmek için polikarbonat kalıp tasarımı değiştirilmiş tek bir multi-kuyu agaroz kamara dökme mm tohumlama kuyu,PDMS ve agaroz daha az kullanır ve 6-plaka (veriler gösterilmemiştir) iyi bir sığar. Yazılan çaplı değişiklikler, iyi tohumlama genişlik, yuvarlak alt eğrilik yarıçapı, tohumlama kuyu, ya da tohum kuyuların derinliği sayısı sadece CNC CAD dosyası özellikleri değiştirerek değiştirilebilir. polikarbonat kalıp işleme. Sonunda, tek bir polikarbonat kalıp PDMS şablonları sınırsız sayıda imal etmek için kullanılan, ve her bir PDMS şablon temizlenir, otoklavlanabilir ve onlarca kez yeniden. Birincil sıçan SMC&#39;lere (Hücre Uygulamaları, R354-05), birincil insan koroner arter SMC&#39;lere (Lonza, CC-2583), birincil insan doku halkalar boyutu değiştirmenin yanı sıra, biz de dahil olmak, pek çok farklı hücre tipleri halkaları yaptık dermal fibroblastlar 11 (Dr George Pins cömert bir hediye, TEFE Biyomedikal Mühendisliği Bölümü), sıçan akciğer fibroblastlar (RFL-6, ATCC CCL-192) ve mezenkimal kök hücreler (Lonza PT-2501). Bu hücre tiplerinin agrega ve doku halkaları oluşturmak için merkezi Mesajları etrafında sözleşmeleri her hücresel organizasyonu, ECM, kompozisyon ve yapıları mekanik özellikleri her hücre tipi için farklı olsa da. Her bir hücre tipi için ekim parametreleri deneysel hücrelerinin büyüklüğü ve yeteneklerini agrega göre tespit edilmelidir. Bu nedenle, hücre kökenli doku halkalar oluşturarak bu sistemi son derece çok yönlü ise, protokol farklı hücre tipleri ile uygun doku oluşumu için ufak ayarlamalar gerekebilir. Doku halka geometri, açıklandığı gibi, tek eksenli çekme testi ile doku malzeme özellikleri, kolay yükleme ve değerlendirme kolaylaştırır. Damar kasılması ve fizyolojik fonksiyonu ölçmek için kan damarı halkanın kullanmak için önemli bir emsal de yoktur. Hazırlık çalışmaları hücre kökenli doku halkaları farmakolojik yanıt ölçümü için bir tel myograph cihazı monte edilebilir olduğunu gösterir vekasılma kuvveti nesil (veriler gösterilmemiştir). Toplamda, yeteneği, histolojik, mekanik, fizyolojik ve biyokimyasal analiz için hızlı bir şekilde kendi kendine monte hücre halkaları imal sağlığı ve hastalıkları, vasküler doku yapısı ve fonksiyonu modelleme için yararlı olabilecek yeni ve güçlü bir araç göstermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog # </th></tr><tr><td> Polidimetilsiloksan (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Lonza </td><td> 50000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15-017-CV </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05-201 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Mediatech </td><td> 30-002-CI </td></tr><tr><td> Dijital görüntüleme sistemi </td><td> DVT Corporation&#39;ın </td><td> Model 630 </td></tr><tr><td> Tek eksenli test makinesi </td><td> Instron </td><td> E1000 ElectroPuls </td></tr><tr><td> Edge Detection Yazılımı </td><td> DVT Corporation&#39;ın </td><td> Çerçeve 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering

Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde her yıl yüzlerce, binlerce hasta koroner arter bypass cerrahisi geçiren bu hastaların 1 yaklaşık üçte biri, hastalığın ilerlemesi ya da bir önceki hasat nedeniyle uygun otolog donör damarları zorunda değilsiniz . Vasküler doku mühendisliği amacı bu bypass greft için uygun bir alternatif kaynak geliştirmek için. Buna ek olarak, vasküler doku mühendisliği, kardiyovasküler hastalıklar çalışmada vasküler modelleri yaşayan gibi değerli ispat edebilir. Hücre tabanlı yöntemler geliştirilmesi ve analizi odaklanan pek çok yeni çalışmalar ile mühendislik kan damarları için bazı umut verici yaklaşımlar incelenmiştir 2-5 Burada, biz hızla kullanılabilir 3D doku halkalar şeklinde kendini monte hücreleri için bir yöntem in vitro vasküler dokuların modeli. Bunu yapmak için, düz kas hücrelerinin süspansiyonlar yuvarlak dipli halkalı agaroz kuyulara numaralı seribaşı. Agaroz yapışkan olmayan özellikleri inci izine hücreleri uyumlu bir doku halkası oluşturmak için kuyunun merkezinde bir yazı, agrega ve sözleşme yerleşmek için 6,7 Bu halkalar, mekanik, fizyolojik, biyokimyasal ve histolojik inceleme için hasat önce birkaç gün süreyle kültüre olabilir . Biz bu hücre kökenli doku halkaları benzer süreleri (&lt;30 kPa) kültüre diğer doku mühendisliği vasküler yapıları için bildirilen değeri aşıyor 100-500 kPa nihai çekme dayanımı 8 verim olduğunu göstermiştir. 9,10 sonuçları bu sağlam hücre göstermektedir kısa bir süre içinde elde edilen damar dokusu halka nesil ve hücreleri ve vasküler doku yapısı ve işlevi hücre kaynaklı matriks (CDM) katkılarıyla doğrudan ve kantitatif değerlendirilmesi için bir fırsat sunmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering at JoVE.com

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Bu makalede, hücresel öz-montaj hücre kökenli doku halkaları oluşturmak için çok yönlü bir yöntem özetlemektedir. Düz kas hücreleri içine numaralı seribaşı halka şeklinde agaroz kuyuları agrega ve 7 gün içinde sağlam bir üç boyutlu (3D) dokular oluşturmak için sözleşme. Milimetre ölçekli doku halkaları mekanik test için elverişli ve doku montaj için yapı taşları olarak hizmet.

Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

directed-cellular-self-assembly-to-fabricate-cell-derived-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.9K Görüntüleme.  Worcester Polytechnic Institute. Bu makalede, hücresel öz-montaj hücre kökenli doku halkaları oluşturmak için çok yönlü bir yöntem özetlemektedir. Düz kas hücreleri içine numaralı seribaşı halka şeklinde agaroz kuyuları agrega ve 7 gün içinde sağlam bir üç boyutlu (3D) dokular oluşturmak için sözleşme. Milimetre ölçekli doku halkaları mekanik test için elverişli ve doku montaj için yapı taşları olarak hizmet.

Video: Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the importance of 3-dimensional (3D) cellular assemblies in these fields. Artificial scaffolds have often been used to construct 3D cellular assemblies. However, the scaffolds used to construct cellular assemblies are sometimes toxic and may change the properties of the cells. Thus, it would be beneficial to establish a non-toxic method for facilitating cell-cell contact. In this paper, we introduce a novel method for constructing stable cellular assemblies by using optical tweezers with dextran. One of the advantages of this method is that it establishes stable cell-to-cell contact within a few minutes. This new method allows the construction of 3D cellular assemblies in a natural hydrophilic polymer and is expected to be useful for constructing next-generation 3D single-cell assemblies in the fields of regenerative medicine and tissue engineering.

We demonstrate a novel method for constructing a single-cell-based 3-dimensional (3D) assembly without an artificial scaffold.

Canlı hücreler yapay iskele olmayan istikrarlı 3D hücresel derleme oluşturmak için değiştirme

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Biyokimya

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Biyomühendislik

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

3D Baskılı Kılavuzları ve Halka İstifleme Yöntemiyle Engineered Vasküler Greft ölçeklendirme

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Hücre tohum için özel özel Wells ve kendinden montajlı 3D baskı kalıpları kullanarak doku yüzük imalatı

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Controlling Electrospun Polymer Morphology for Tissue Engineering Demonstrated Using hepG2 Cell Line

Electrospinning affords researchers the opportunity to fabricate reproducible micro to nanoscale polymer fibers. The 3D fibrous architecture of electrospun polymers is regarded as a structural imitation of the extracellular matrix (ECM). Hence, electrospun fibers fabricated from biocompatible polymers have been widely investigated by tissue engineering researchers for their potential role as an artificial ECM for guiding tissue growth both in vitro and in vivo. All cells are acutely sensitive to their mechanical environment. This has been demonstrated by the discovery of multiple mechanotransduction pathways intrinsically linked to the cytoskeletal actin filaments. The cytoskeleton acts as a mechanical sensor that can direct the functionality and differentiation of the host cell depending on the stiffness and morphology of its substrate. Electrospun fibers can be tuned both in terms of fiber size and morphology to easily modulate the mechanical environment within a fibrous polymer scaffold. Here, methods for electrospinning polycaprolactone (PCL) for three distinct morphologies at two different fiber diameters are described. The morphological fiber categories consist of randomly oriented fibers, aligned fibers, and porous cryogenically spun fibers, with 1 &#181;m and 5 &#181;m diameters. The methods detailed within this study are proposed as a platform for investigating the effect of electrospun fiber architecture on tissue generation. Understanding these effects will allow researchers to optimize the mechanical properties of electrospun fibers and demonstrate the potential of this technology more thoroughly.

This method provides the means to test different polycaprolactone fiber morphologies and topographies for the purpose of tissue engineering. Small and large fibers are fabricated with random orientations, aligned orientations, and also porous cryogenically electrospun structures and used as platforms for cell culture.

Electrospinning affords researchers the opportunity to fabricate reproducible micro to nanoscale polymer fibers. The 3D fibrous architecture of ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

DNA Kullanarak Hücrelerin Basit, Uygun Fiyatlı ve Modüler Deseni

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Fibroblast Türetilmiş İnsan Tarafından Tasarlanmış Bağ Dokusu Tarama Uygulamaları için

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...