Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

我们正在进行功能基因组学研究，重点是识别和表征人类基因组中的功能元件。我们的主要兴趣是探索基因组中尚未得到充分分配的部分，以更好地了解它们的潜在作用以及它们如何为人类生物学和疾病做出贡献。目前的反向遗传学工具存在一些局限性，例如非特异性效应和创建复杂的 SSI 或 SGI 文库的成本高。

另一个挑战是，这种方法可能只针对分配的基因组元件，而基因组的很大一部分没有得到充分探索。这里开发的方案提供了一种识别以前未知的基因组元件的新方法，包括蛋白质编码和长编码眼中的新型功能性外显子。首先，使用从基于慢病毒的插入诱变细胞文库中分离的基因组 DNA 作为模板，在 50 μL 反应中进行线性 PCR。然后。

在 PCR 管中添加此处显示的其他所需试剂。在给定的 PCR 条件下，在标准热循环仪中进行 50 个循环的线性 PCR。将 PCR 产物转移到新的干净的 1.5 ml 离心管中。

将 PCR 产物与 10 μL 生物素-链霉亲和素磁珠充分混合，并在室温下孵育混合物 2 小时，在金属浴中以 400 RPM 振荡。然后，使用磁力架收集磁珠并小心去除上清液。用 300 μL 结合或洗涤缓冲液洗涤珠子 6 次，每次洗涤后弃去上清液。

对于第二链合成，将微珠重悬于 PCR 管中含有 Klenow 片段缓冲液、DNTP 混合物和 P5N6 引物的 24 μL 反应体积中。在 PCR 热循环仪中将混合物在 15 °C 下预孵育 20 分钟，然后向反应混合物中加入两个单位的 Klenow 片段。在给定条件下，在 PCR 热循环仪中孵育混合物。

然后，将 PCR 产物转移到新的干净的 1.5 ml 离心管中。使用磁力架捕获磁珠并丢弃上清液。之后，在 4 摄氏度下用 300 微升 DNase 和不含 RNase 的蒸馏水轻轻洗涤珠子。

收集珠子并丢弃上清液。在 PCR 管中将微珠重悬于 25 μL PCR 反应体积中，该体积含有 Taq 缓冲液、Taq DNA 聚合酶、引物 P5、DNTP 混合物和引物 3-LTR_Nest。使用此处显示的设置在热循环仪中进行 PCR。

使用 5 微升 PCR 产物作为模板，使用引物 Illumina P5 和引物 Illumina P73-LTR 进行下一轮 PCR 反应。在给定条件下在热循环仪中进行 PCR。然后，将 PCR 产物转移到干净的 1.5 mL离心管中。

将微珠从 2 °C 平衡至 8 °C 至室温 30 分钟后，通过倒置或涡旋彻底混合微珠。将 1.2 倍体积的珠子移液到干净的 1.5 毫升离心管中。将 PCR 产物添加到珠子中，上下吹打 10 次，充分混合。

孵育磁珠，让 DNA 与它们结合。然后，将样品放在磁力架上，溶液澄清后去除上清液。现在，用 200 微升 80% 乙醇洗涤珠子。

在室温下孵育 30 秒，然后去除上清液。在室温下风干珠子，打开盖子约 5 分钟。现在，从磁力架上取下管子。

加入 22 μL 不含 DNase 和 RNase 的蒸馏水。上下吹打 10 次，充分混匀，并在室温下静置 2 分钟。将试管放回磁力架上，直到溶液澄清。

然后，将 21 μL 上清液转移到干净的 1.5 mL离心管中。要使用荧光计测量浓度，请以 1 比 200 的比例混合试剂和缓冲液来制备工作溶液。混合 10 微升标准品 1 和 10 微升标准品 2，每剂与 190 微升工作溶液混合，以制备检测标准品。

轻轻涡旋混合物 2 到 3 秒钟。接下来，通过将 1 μL 纯化的 PCR 产物与 199 μL 的工作溶液混合来制备检测样品。轻轻涡旋混合物 2 到 3 秒钟。

将检测标准品和检测样品在室温下孵育 2 分钟，避光保存，然后打开荧光计。从主菜单中选择双链 DNA 高灵敏度检测程序。校准时，将标准品 1 插入机器，然后按下读取标准按钮以测量第一个标准品。

然后，插入标准品 2 并按下读取标准品按钮测量第二个标准品。对于样品测量，按 Run samples 按钮进入样品测量页面。插入每个包含检测样品的试管，然后按下读取试管按钮以获得浓度。

在低质量样品中，83 个碱基对附近的主峰表明接头二聚体污染。相比之下，高质量的 NGS 文库显示 150 到 1， 500 个碱基对之间的主峰，反映了成功文库的概况。