这种方法可以帮助回答艾滋病毒原病毒整合如何影响和性基因表达的问题，以及为什么某些基因组整合点被选择到最近HIV感染的细胞中。这项技术的主要优点是，可以生成HIV感染的体外模型，该模型使用基于CRISPR/Cas9的基因组工程，将亲病毒的测量仪靶向选定的整合地点。演示这个程序的将是托马斯·沃尔瑟，一个博士生，和朱莉娅·比亚莱克，一个博士后从我的实验室。
首先使用 UCSC 基因组浏览器对所需的基因组位点进行硅内提取基因组序列。要选择 20 个核苷酸的指南 RNA 来定位所选基因组位点，请使用 E-CRISP 网络工具。然后选择，人类萨皮恩斯基因组参考联盟人类基因组:建立38。
参考基因组作为生物体，输入2000个基因组序列碱基对，覆盖先前提取的所需基因组位点。使用任何 PAM 的中等应用设置开始引导 RNA 搜索，任何五基、非目标都允许不匹配和排除的内向和 CPG 孤岛。从显示的可能指南RNA设计的列表中，选择具有高分的引导RNA的特异性和效率，该指南RNA尽可能接近所需的基因组位点。
打开 NCBI 爆炸浏览器，对参考基因组进行选定的指南RNA序列。要检查所选指南RNA结合位点的独特性，首先选择人类作为基因组，然后输入指南RNA序列作为查询序列。然后选择高度相似的序列或巨型爆炸作为程序，以确保引导RNA序列是唯一的。
之后，从开始提取的基因组序列中选择1000个基对，上游和下游的引导RNA序列。使用这些选定的1000个碱基对，上游和下游作为五等和三等同臂，以目标向量构造和相邻的报告序列为目标。在转染的jurkat T细胞前24小时，为单个靶向实验准备一个完整的6井板。
首先，每井有2.5毫升的RPMI 1640，没有抗生素，在2.5毫升的细胞中， 1，250，000个细胞。第二天，将圆形靶向量和两微克的Cas9和引导RNA表达质粒添加到每孔的250微升商用RPMI介质中，在反应管中，通过涡旋混合。然后缓慢地将12微升的转染剂加入DNA介质，而不接触管壁。
轻拂管子，在室温下孵育15分钟。将混合物滴入一个细胞井中。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞。
转染72小时后，拉转染细胞，计数，并准备由FACS富集。在确认混合靶向细胞群体中的靶向事件后，通过提前制备由jurkat条件培养基开始生成单细胞克隆，从健康、未经治疗的jurkat T细胞中采集RPMI的抗生素。在 300 G 下将管离心 5 分钟，使用 0.22 微米过滤器将上清液过滤到新的 50 毫升锥形管中。
计算以前由FACS富集的目标细胞，在扩张10至14天后，然后用抗生素在RPMI中稀释它们，浓度为每毫升10万细胞。用9.9毫升的介质稀释100微升的细胞，达到每毫升1000个细胞。然后用9毫升的中到浓度为每毫升100个细胞稀释一毫升。
将 96 孔板板，每孔包含一个细胞，在无菌试剂库中，将 1 毫升 100 细胞/毫升溶液与 5 毫升条件介质和 4 毫升新鲜介质混合。然后，使用多通道移液器，每孔新96孔圆形底板添加100微升各细胞稀释，实现每孔稀释一个和两个细胞。堆叠 96 个孔板，用每孔包含 3 毫升 PBS 的六孔板覆盖每个孔。
在加湿的培养箱中用5%的二氧化碳孵化板孵育三周。完成孵育后，目视地确认生长菌落的存在，使用四倍放大倍率的光显微镜，并标记与生长菌落的井。轻轻重新暂停一个通过移液标记良好的细胞。
将该细胞悬浮液的 100 微升转移到一个新鲜准备的 96 孔圆形底板中，其中 100 微升的 RPMI 与抗生素，每孔并对所有标记的孔重复，通过移液轻轻混合。要复制板，请将该电池悬浮液的 100 微升转移到第二个空的 96 孔圆底板中，并对所有标记的孔重复此过程。最后，用200微升RPMI用抗生素填充空白井。
在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板。重复板孵育24至48小时后，通过在每一个井中加入100微升的RPMI和抗生素，再次复制。使用多通道移液器轻轻混合，将 100 微升转移到新 96 井圆底板的每个井中。
将这两个重复的板之一放在培养箱中。使用第二个新的重复板流动细胞学，首先添加五微升的PMA/Ionomycin主混合每孔，以刺激细胞。孵育24小时，并准备细胞流动细胞测量，如文本所述。
根据向前和侧散射的大小，将任何可行的单个细胞栅极。通过流式细胞学分析荧光记者基因表达。要按PCR筛选单细胞克隆，设计底源P5和P6，根据所选的检测器序列筛选PCR，放大500到800个应报序列的基对。
对于正对PCR，设计底源P7和P8，可放大野生型非靶向基因组位点630个碱基对。设计第三个底像对，放大目标向量主干的 500 到 600 个基对，作为目标向量主干序列非特异性集成的控制。一旦第二个重复板中的克隆足够生长，在室温下先在300-G下离心10分钟，为PCR筛查做好准备。
小心地取出上一液，确保不要干扰细胞颗粒。用100微升PBS洗涤细胞，通过轻轻移液，在室温下在300G下离心5分钟。拆下 PBS，每井添加 200 微升的解液缓冲液。
轻轻混合，将悬挂转移到新的PCR板。用石蜡膜密封板，在55摄氏度的热循环器中孵育一小时。以最大速度离心 10 分钟后，将上经液转移到新的 PCR 板上。
在每井中，每井都加入10微升的细胞，将每井充满110微升的蒸馏H2O的PCR板的每一个井中。然后在99摄氏度的热循环中孵育10分钟，以灭活蛋白酶K.使用该细胞的2微升作为模板，并使用商用PCR主混合物进行筛选、控制和骨干PCR。以 96 井格式运行 PCR，进行 38 到 40 个周期的 PCR 放大。
使用五微升的PCR产品，并在1.5%的阿加罗斯TAE凝胶上运行，以分析和结合流式细胞学和PCR结果，以确认单细胞克隆。记者基因表达后PMA/Ionomycin诱导被确认的流动细胞学和PCR在4至12%的细胞，取决于整合位点。利用五等和三等融合交汇点的基因组DNA的PCR分析，证实发生了靶向事件。
在通过流细胞学对单细胞克隆进行正确靶向筛选后，观察到高、低、无荧光检测器基因表达的克隆。PCR 也使用特定于记者的底向器和控制底向器确认了单细胞克隆。克隆在筛选PCR中确认为阳性，使用记者特异性探针和记者外部的基因组探针结合，对南方印迹的正确靶向进行了进一步分析。
只有一部分在南方印迹分析中显示了正确的波段大小，并且与记者进行了异质整合，这表明通过南方印迹验证PCR结果很重要。克隆也通过测序进行分析，以进一步确认阳性的单细胞克隆。目标位点测序:同源等位基因，被记者未整合，揭示了Cas9诱发的突变。
一旦掌握，艾滋病毒记者线的生成可以在两到三个月内完成。在定位之前，根据您要处理的研究问题，在适当的记者中花费足够的时间选择集成站点非常重要。例如，如果需要，记者可以包括不同的艾滋病毒监管要素。
按照此过程，单元系可用于测试不同延迟上升代理对报告器 LTR 的转录活动的影响，具体取决于其集成站点。观看此视频后，您应该清楚地了解如何生成集成站点特定的 HIV 报告线，以便设计指南 RNA 和靶向载体、在 jurkat 细胞中执行基于 CRISPR/Cas9 的基因组工程、生成单细胞克隆以及通过 FACS 和 PCR 筛选选择正确的靶向克隆。不要忘记，如果您选择使用具有复制功能的 HIV 报告服务器，则需要在 BSL3 安全条件下工作。
