Estamos conduzindo pesquisas em genômica funcional com foco na identificação e caracterização dos elementos funcionais dentro do genoma humano. Nosso principal interesse é explorar a parte do genoma que ainda não foi bem alocada para entender melhor seus papéis potenciais e como eles podem contribuir para a biologia e doenças humanas. As ferramentas atuais de genética reversa têm algumas limitações, como efeitos inespecíficos e alto custo na criação de bibliotecas complexas de SSIs ou SGIs.
Outro desafio é que esse método pode ter como alvo apenas elementos genômicos alocados, deixando uma grande parte do genoma inexplorada. O protocolo desenvolvido aqui oferece uma nova abordagem para identificar elementos genômicos anteriormente desconhecidos, incluindo novos éxons funcionais tanto na codificação de proteínas quanto em olhos de codificação longos. Para começar, use DNA genômico isolado de uma biblioteca de células de mutagênese insercional baseada em lentivírus como modelo para uma PCR linear em uma reação de 50 microlitros. Então.
adicione os outros reagentes necessários mostrados aqui no tubo de PCR. Execute 50 ciclos de PCR linear em um termociclador padrão sob as condições de PCR fornecidas. Transfira os produtos de PCR para um novo tubo de centrífuga limpo de 1,5 mililitro.
Misture bem os produtos de PCR com 10 microlitros de esferas magnéticas de biotina-estreptavidina e incube a mistura por duas horas em temperatura ambiente, agitando a 400 RPM em um banho de metal. Em seguida, use um suporte magnético para coletar as contas e remova cuidadosamente o sobrenadante. Lave as contas com 300 microlitros de ligação ou tampão de lavagem seis vezes, descartando o sobrenadante após cada lavagem.
Para a síntese da segunda fita, ressuspenda os grânulos em um volume de reação de 24 microlitros contendo tampão de fragmento de Klenow, mistura DNTP e primer P5N6 em um tubo de PCR. Pré-incubar a mistura a 15 graus Celsius por 20 minutos em um termociclador de PCR e, em seguida, adicionar duas unidades de fragmento de Klenow à mistura de reação. Incubar as misturas em um termociclador PCR nas condições dadas.
Em seguida, transfira os produtos de PCR para um novo tubo de centrífuga limpo de 1,5 mililitro. Use um suporte magnético para capturar as contas e descartar o sobrenadante. Depois disso, lave as esferas suavemente com 300 microlitros de água destilada livre de DNase e RNase a quatro graus Celsius.
Colete as contas e descarte o sobrenadante. Ressuspenda as esferas em um volume de reação de PCR de 25 microlitros contendo tampão Taq, Taq DNA polimerase, primer P5, mistura DNTP e primer 3-LTR_Nest em um tubo de PCR. Execute a PCR em um termociclador com as configurações mostradas aqui.
Use cinco microlitros dos produtos de PCR como modelo para a próxima rodada de reação de PCR com o primer Illumina P5 e o primer Illumina P73-LTR. Realize a PCR em um termociclador nas condições dadas. Em seguida, transfira os produtos de PCR para um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mililitro.
Depois de equilibrar as contas de dois a oito graus Celsius à temperatura ambiente por 30 minutos, misture bem as contas invertendo ou vórtice. Pipete 1,2 vezes o volume das esferas em um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mililitro. Adicione os produtos de PCR às esferas e misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
Incube as contas para permitir que o DNA se ligue a elas. Em seguida, coloque as amostras em um suporte magnético e remova o sobrenadante assim que a solução estiver límpida. Agora, lave as esferas com 200 microlitros de etanol a 80%.
Incubar à temperatura ambiente durante 30 segundos e remover o sobrenadante. Seque as contas ao ar em temperatura ambiente com a tampa aberta por aproximadamente cinco minutos. Agora, remova o tubo do suporte magnético.
Adicione 22 microlitros de água destilada sem DNase e RNase. Misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes e deixe descansar em temperatura ambiente por dois minutos. Coloque o tubo de volta no suporte magnético até que a solução esteja límpida.
Em seguida, transfira 21 microlitros do sobrenadante para um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mililitro. Para medir a concentração com o fluorômetro, prepare a solução de trabalho misturando o reagente e o tampão na proporção de um para 200. Misture 10 microlitros do padrão um e 10 microlitros do padrão dois, cada um com 190 microlitros de solução de trabalho, para preparar os padrões de ensaio.
Agite suavemente as misturas por dois a três segundos. Em seguida, prepare a amostra de ensaio misturando um microlitro dos produtos de PCR purificados com 199 microlitros de solução de trabalho. Agite suavemente a mistura por dois a três segundos.
Incube os padrões de ensaio e as amostras de ensaio por dois minutos em temperatura ambiente, mantendo-as protegidas da luz e, em seguida, ligue o fluorímetro. Selecione o programa de ensaio de alta sensibilidade de DNA de fita dupla no menu principal. Para calibração, insira o padrão um na máquina e pressione o botão de leitura padrão para medir o primeiro padrão.
Em seguida, insira o padrão dois e pressione o botão de leitura padrão para medir o segundo padrão. Para medição de amostra, pressione o botão executar amostras para ir para a página de medição de amostra. Insira cada tubo contendo a amostra de ensaio e pressione o botão do tubo de leitura para obter a concentração.
Na amostra de baixa qualidade, um pico dominante em torno de 83 pares de bases indica contaminação do dímero do adaptador. Em contraste, a biblioteca NGS de alta qualidade exibe picos principais entre 150 e 1.500 pares de bases, refletindo o perfil de uma biblioteca bem-sucedida.
