私たちは、ヒトゲノム内の機能的要素の同定と特性評価に焦点を当てた機能ゲノミクスの研究を行っています。私たちの主な関心は、ゲノムのまだ十分に割り当てられていない部分を探索し、その潜在的な役割と、それらが人間の生物学や病気にどのように寄与するかをよりよく理解することです。現在のリバースジェネティクスツールには、非特異的な効果や、SSIまたはSGIの複雑なライブラリを作成する際の高コストなど、いくつかの制限があります。
また、この方法では、割り当てられたゲノム要素のみを対象とするため、ゲノムの大部分が未調査のままであるという課題もあります。ここで開発されたプロトコールは、タンパク質コードとロングコーディングアイの両方における新規の機能的エクソンを含む、これまで知られていなかったゲノム要素を同定するための新しいアプローチを提供します。まず、レンチウイルスベースの挿入突然変異誘発細胞ライブラリーから単離されたゲノムDNAを、50マイクロリットルの反応でリニアPCRするためのテンプレートとして使用します。そうしたら。
ここに示されている他の必要な試薬をPCRチューブに加えます。所定のPCR条件下で、標準的なサーモサイクラーで50サイクルのリニアPCRを実行します。PCR産物を新しい清潔な1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。
PCR産物を10マイクロリットルのビオチン-ストレプトアビジン磁気ビーズと十分に混合し、金属浴中で400RPMで振とうしながら室温で2時間インキュベートします。次に、磁気スタンドを使用してビーズを収集し、上清を慎重に取り除きます。ビーズを300マイクロリットルの結合液または洗浄緩衝液で6回洗浄し、洗浄するたびに上清を廃棄します。
第2鎖合成では、Klenowフラグメントバッファー、DNTP混合物、およびPCRチューブ内のP5N6プライマーを含む24μLの反応容量にビーズを再懸濁します。混合物を摂氏15度でPCRサーモサイクラーで20分間事前にインキュベートし、次に反応混合物に2ユニットのKlenowフラグメントを添加します。所定の条件下でPCRサーモサイクラーで混合物をインキュベートします。
次に、PCR産物を新しいきれいな1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。磁気スタンドを使用してビーズを捕捉し、上清を捨てます。その後、300マイクロリットルのDNaseおよびRNaseフリー蒸留水で摂氏4度でビーズをやさしく洗います。
ビーズを集めて上清を捨てます。Taqバッファー、Taq DNAポリメラーゼ、プライマーP5、DNTP混合物、およびプライマー3-LTR_Nestを含む25マイクロリットルのPCR反応容量にビーズを再懸濁します。サーモサイクラーで、ここに示す設定でPCRを実行します。
プライマーIllumina P5およびプライマーIllumina P73-LTRを使用した次のPCR反応のテンプレートとして、5マイクロリットルのPCR産物を使用してください。所定の条件下でサーモサイクラーでPCRを実行します。次に、PCR産物を清潔な1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。
ビーズを摂氏2度から8度まで室温で30分間平衡化した後、ビーズを反転またはボルテックスして完全に混合します。ビーズの容量の1.2倍をきれいな1.5ミリリットルの遠心分離管にピペットで移します。PCR産物をビーズに加え、ピペッティングで10回上下させて十分に混合します。
ビーズをインキュベートして、DNAがビーズに結合できるようにします。次に、サンプルを磁気スタンドに置き、溶液が透明になったら上清を取り除きます。次に、ビーズを200マイクロリットルの80%エタノールで洗います。
室温で30秒間インキュベートし、上清を取り除きます。蓋を開けた状態でビーズを室温で約5分間風乾します。次に、チューブをマグネットスタンドから取り外します。
22マイクロリットルのDNaseおよびRNaseフリー蒸留水を追加します。ピペッティングで10回上下させて十分に混合し、室温で2分間放置します。溶液が透明になるまで、チューブを磁気スタンドに戻します。
次に、21マイクロリットルの上清をきれいな1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。蛍光光度計で濃度を測定するには、試薬とバッファーを1対200の比率で混合して作業溶液を調製します。10マイクロリットルの標準1と10マイクロリットルの標準2を、それぞれ190マイクロリットルの作業溶液と混合して、アッセイ標準を調製します。
混合物を2〜3秒間穏やかに渦巻きにします。次に、精製したPCR産物1マイクロリットルと199マイクロリットルの作業溶液を混合して、アッセイサンプルを調製します。混合物を2〜3秒間穏やかに渦巻きにします。
アッセイスタンダードとアッセイサンプルを室温で2分間インキュベートし、光から保護した後、蛍光計をオンにします。メインメニューから二本鎖DNA高感度アッセイプログラムを選択します。キャリブレーションには、標準のものをマシンに挿入し、読み取り標準ボタンを押して最初の標準を測定します。
次に、標準2を挿入し、読み取り標準ボタンを押して2番目の標準を測定します。サンプル測定の場合は、サンプルの実行ボタンを押してサンプル測定ページに移動します。アッセイサンプルが入った各チューブを挿入し、読み取りチューブボタンを押して濃度を求めます。
低品質のサンプルでは、83塩基対付近の支配的なピークは、アダプターダイマーの汚染を示しています。対照的に、高品質のNGSライブラリは、成功したライブラリのプロファイルを反映して、150〜1, 500塩基対のメインピークを表示します。
