体内 小鼠下颌下腺血管通透性检测

本协议描述了一种体内细胞旁通透性检测措施，以评估小鼠下颌下腺中紧密内皮连接的功能。然而，双光子激光扫描显微镜不仅具有传统共聚焦显微镜的优势，而且还可用于更清晰地检测更深的组织和图像。本实验为评估不同组织特别是动物表面组织和器官的血管通透性提供了很好的方法测量方法。

首先选择合适的示踪剂，例如荧光素、异硫氰酸酯（标记的葡聚糖）和罗丹明B（标记的右旋糖酐）具有不同的激发发射光谱，以最大程度地减少渗透性测定中荧光信号之间的干扰。将痕量稀释到无菌磷酸盐缓冲盐水中，制成每毫升100毫克的储备液，并将等分试样储存在零下20摄氏度的避光处。麻醉8至10周龄雄性野生型小鼠后，轻轻握住小鼠的头部和颈部，使眼球的一侧略微突出。

沿眼角以直角插入含有100微升荧光示踪剂溶液混合物的胰岛素注射器。注射后，快速将鼠标以仰卧姿势放在纸板上，四肢和头部贴上胶带。对于下颌下腺或SMG分离，在体视显微镜下，用一般组织剪刀切开颈部表皮，以暴露SMG的两侧。

接下来，使用钝的组织分离针轻轻地将胶囊与腺体表面分开，而不会损坏腺体组织、血管和腺体结构。将定制的支架连接到负压装置上，并提前检查负压效果是否正确实现。将暴露的SMG轻轻放在定制的支架上，并通过负压吸力吸起组织，尽可能远离小鼠身体，以减少呼吸和其他条件引起的运动伪影。

选择腺体部位后不久开始成像。沿Z轴获取连续图像，从腺体表面相距2微米，进入组织70至140微米，以生成三维结构。接下来，获取血管的延时成像以测量SMG中的血管通透性。

在"资源管理器"对话框中，单击"添加新文件夹"并更改文件名。然后，返回到"流量获取"列。在 XY 中，格式为 512 x 512，速度为 400 赫兹。

打开双向 X"，将缩放系数设置为 0.75 和 1.5 以进行缩放。接下来，在"采集模式"下选择XYT"获取延时成像。根据实验需要将持续时间设置为20秒，30分钟或更长。

设置条件后，单击Live"以观察照片形成框中两个通道和重叠通道的血管成像并选择感兴趣的区域。点击 开始"开始成像。体内血管通透性测定，以及小鼠血管的三维图像。

此处显示了下颌下腺。在对照组中，两种示踪剂都存在于SMG的血管中。由于其分子量小，FD4能够从血管泄漏到腺泡和导管的基底侧，从而清楚地描绘出腺泡和导管的形状。

RD70分布在大血管和微型血管中。在导管结扎组中，FD4和RD70均外渗至腺泡基底侧，表明导管结扎可破坏内皮屏障功能，增加对大分子的通透性。此外，半定量FD4和RD70荧光强度结果证实了这些观察结果。

与对照组相比，三维图像显示结扎组血管周围FD4和RD70的荧光更加模糊。仔细的SMG隔离和适当的放置以及显微镜是成功检测的必要先决条件。按照这些程序，可以通过结合红细胞的运动来计算血流速率，并且可以追踪荧光标记的血细胞的浸润。