子宫内膜异位症异种小鼠病变大小的无创监测

该方法有助于回答评估子宫内膜异位症治疗药物效果的关键问题，如抗雄激素化合物对子宫内膜异位体病变大小的影响。这种技术的主要优点是，特定药物的效果可以在子宫内膜异位症的动物模型中实时评估，而不是在终点。演示手术将是杰西卡马丁内斯，这是一个技术人员从我的实验室，以及维维亚娜比斯巴尔和内雷亚马林，他们是兽医从普林西比费利佩调查，他们是与我们的团队密切合作。

在植入手术前两到三天，将冲洗后的健康子宫内膜组织活检片段转移到含有完整培养的10厘米培养皿中，并用手术刀将组织切碎成5至10毫米的立方体。使用微管，在新的10厘米培养盘底部加入30至50微升的DMEM滴，在每滴之间留下足够的空间，这样它们之间的接触就不相互接触。当所有滴液都放置后，使用注射器针将一块活检组织片段放入每滴中。

接下来，将100至200微升新鲜准备好的腺膜加入每个组织片段的96孔板的一口井中，外加三口无腺病毒DMEM的井作为负对。然后使用针头将一个组织样本转移到腺溶液的每个井中，在37摄氏度和5%CO2下进行过夜孵化。第二天早上，将板放在荧光显微镜阶段，并使用568纳米激光检查碎片，以找到最佳标签。

使用适当的稀释感染mCherry腺病毒是有效标记组织的关键。因此，要确定适当的浓度，几个为mCherry稀释，每个单独的实验，必须评估。然后将最辉煌的碎片转移到包含新鲜、完整介质的新 96 井板的单个孔中。

卵巢切除术后至少七天，将子宫内膜组织碎片放入培养皿中，并确认麻醉、卵巢切除动物对头趾捏缺乏反应。用鼠标在上部位置消毒腹体区域，并在腹部进行1.5厘米的纵向切口。将皮肤与肌肉分开，在肌肉中进行第二个1.5厘米切口，以进入腹腔。

用迷你钳握住腹部肌肉壁的左边缘，折叠肌肉以暴露动物外侧腹膜的内脸。使用迷你钳子将一个子宫内膜植入物短暂地浸泡在 n-丁基酯氰丙烯酸酯胶粘剂中，将片段附着在内膜上。当粘合剂干燥时，将第二个植入物放在膜内膜的对侧侧，正如刚刚演示的。

使用可吸收的 6-0 缝合线关闭肌肉层，使用不可吸收的 6-0 缝合线关闭皮肤。然后用防腐剂溶液清洁皮肤切口，将动物放在恢复区进行监测，直到完全恢复。对于植入组织片段的体内荧光成像，植入手术后 24 至 48 小时打开体内成像系统，初始化软件，并允许 CCD 摄像机冷却几分钟。

仪器准备就绪后，将第一只麻醉小鼠放入体内成像系统保持架，在上呼吸位处，将头部插入连接到麻醉机的浴缸内，然后合上盖子。然后单击"获取"并保存生成的五个图像。要量化体内荧光，请在相应的图像分析软件中单击浏览并选择要分析的未混合文件。

将出现一个新窗口。单击"添加到列表"以包括不同时间点上每个动物的所有未混合文件，然后单击加载作为一个组。所有图像应以单个顺序显示。

在工具调色板窗口中，取消选中单个比例复选框以将所有图像调整到相同的比例，然后双击序列的一个图像。要创建感兴趣区域，在感兴趣区域中，工具选择轮廓和自动一个选项，然后单击圆形状将圆放在荧光信号的中心。单击"创建"以创建感兴趣区域，并在没有信号的背景上复制和粘贴感兴趣的区域。

然后单击测量感兴趣区域并选择全部以显示每个区域的荧光强度值，然后复制这些值并将其粘贴到电子表格中。子宫内膜碎片的标签是通过感染腺病毒实现的，该腺病毒被设计成表达mCherry，一种在近红外部分发出荧光的蛋白质，比未受感染的子宫内膜组织自动荧光要强得多。在监测过程中，除了mCherry的参考波长外，荧光图像还用不同对的激发发射波长滤波器拍摄。

为了定义从背景到病变的特征荧光组织发射特征，以及宿主组织发射的自荧光，将动物在每个时间点中发出的含有原始荧光的监测图像汇集在一起，非正则化。接下来，荧光被解混合、规范化，并表示为假彩色图像，并且与特定军团和背景信号对应的兴趣区域由程序自动识别并量化。兴趣信令的背景区域从兴趣信号的军团区域中减去。

并且每个时间点的强度结果与强度最大化的时间点进行规范化。经过几个星期的监测，可行的植入物可以恢复，以进一步下游分析。在尝试此过程时，重要的是要记住选择 Ad-mCherry 的浓度，该浓度提供最辉煌的信号，同时不影响组织的生存能力。

按照这个程序，病变可以恢复，并用于研究其他独特的参数。该程序针对异种移植人类子宫内膜异位体异位异位病病变的非侵入性监测进行了优化。然而，它可以很容易地适应评估特定药物对异种移植网站的实时影响。