من أجل تطوير الأدوية والمركبات الجديدة التي تستهدف الأورام في الجهاز العصبي المركزي ، فإن إمكانية الوصول والمرور عبر حاجز الدم في الدماغ أمر بالغ الأهمية. على الرغم من أن السمية الخلوية للمركبات يمكن قياسها بسهولة عن طريق احتضان الخلايا بالجزيئات العلاجية ، إلا أنها لا تخبر أي شيء عن التسليم الفعلي لموقع الورم في الدماغ. لمعالجة هذه المسألة، وضعنا البروتوكول التالي الذي يصف كيفية إعادة إنشاء حاجز ورم الدم في الدماغ في المختبر على طبق.
استخدام الخلايا الخالدة من مورين أو أصل بشري يجعل هذا الفحص مرن جدا. ويمكن أيضا أن تحجيم بسهولة تصل إلى الشاشة العشرات من المركبات مع استنساخ عالية. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب على حد سواء الكم والتصور من مرور واستهداف قدرة المركبات قبل المضي قدما مع النماذج قبل الظهر.
ولذلك، فإن أسلوبنا يستبدل جزئيا نماذج الحيوان باستخدام خطوط الخلية المحددة مسبقا. إدراج الخلايا السرطانية في الدماغ المستمدة من المريض يُقَسَّمُ عدم تجانس المريض، بينما يضمن استخدام الخلايا الخالدة لإنشاء حاجز الدم في الدماغ إمكانية إعادة إنتاج النتائج. بالإجمال, هذا الدم في الدماغ حاجز نموذج يقدم أداة مثيرة للاهتمام حقاً إلى اختبار انتشار المخدرات أو تسليم مركبات المخدرات.
العرض التوضيحي المرئي للأسلوب أمر بالغ الأهمية لأن seeding الخلايا في الجانب الآخر من إدراج تتطلب معالجة التي لا يتم وصفها في كثير من الأحيان في بروتوكولات أخرى باستخدام برنامج إعداد مشابهة. على سبيل المثال، الحصول على التصاق الخلايا الفلكية عندما يتم وضع إدراج رأسا على عقب فوائد عالية من التمثيل البصري. تحت غطاء معقمة ثقافة الخلية، وغسل بعناية الخلايا الفلكية مثقف مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة.
استخدام مضخة فراغ لتجاهل بلطف برنامج تلفزيوني، وإضافة ملليلتر من خلية كاشف تفكك لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا. ثم، إضافة 10 ملليلتر من العقيمة كاملة ثقافة الخلايا الفلكية المتوسطة إلى السفينة لمنع نشاط كاشف تفكك الخلية. استخدم ماصة مصلية معقمة لنقل الخلايا المنفصلة من الوعاء إلى أنبوب معقمة 15 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي في 250 مرة ز لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. وفي الوقت نفسه، حدد إدراج. استخدام ملقط العقيمة لوضع إدراج مع الجانب الدماغ حتى على غطاء لوحة ستة جيدا العقيمة.
عندما يكون الطرد المركزي كاملا، بعناية تجاهل supernatant من تعليق الخلية، وإعادة تعليق بيليه استروسيتي في ملليلتر واحد من ABM زائد عن طريق الأنابيب بلطف بيليه على جدار الأنبوب تصل إلى خمس مرات. ثم، عد الخلايا، وضبط كثافة تعليق الخلية إلى 150،000 الخلايا في 400 ميكرولترات من ABM زائد لكل إدراج. ضع تعليق الخلية في منتصف جانب الدماغ من غشاء الإدراج ، والانتشار بعناية باستخدام قوة الشعيرات الدموية مع طرف ماص معقمة.
مع الجانب الدماغ من إدراج لا يزال حتى, وضع لوحة ستة جيدا مرة أخرى على إدراج. وضع لوحة وإدراج، مع الجانب الدماغ حتى، في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح للتصاق الخلية. بعد هذا, العودة إلى لوحة ستة جيدا مرة أخرى إلى موقفها العادي, مع إدراج الآن جانب الدم.
إضافة متوسطة، ومتابعة الحضانة كما هو موضح في بروتوكول النص. تحت غطاء معقمة ثقافة الخلية، وغسل بعناية الخلايا البطانية مثقف مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة. استخدام مضخة فراغ لتجاهل بلطف برنامج تلفزيوني، وإضافة ملليلتر من خلية كاشف تفكك لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا.
ثم، إضافة 10 ملليلتر من العقيمة كاملة ثقافة الخلايا البطانية المتوسطة إلى السفينة لمنع نشاط كاشف تفكك الخلية. استخدم ماصة مصلية معقمة لنقل الخلايا المنفصلة من الوعاء إلى أنبوب معقمة 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 250 مرة ز لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد هذا، والتخلص من supernatant، وإعادة تعليق بيليه الخلية البطانية في ملليلتر واحد من EBM زائد عن طريق الأنابيب ببطء تعليق الخلية على جدار الأنبوب تصل إلى خمس مرات. عد الخلايا، وضبط كثافة تعليق الخلية إلى 200،000 الخلايا في 2.5 ملليلتر من ثقافة الخلايا البطانية خالية من المصل وعائيا عامل النمو البطانية-A لكل إدراج. استرداد لوحة تحتوي على إدراج.
تجاهل بعناية المتوسطة من جانب الدم، واستبدالها مع 2.5 ملليلتر من تعليق الخلايا البطانية. ثم، العودة إلى لوحة الحاضنة، وترك الأمر بين عشية وضحاها للسماح للخلايا البطانية للتمسك الغشاء. في اليوم التالي، وإعداد لوحة ستة جيدا عن طريق نقل ثلاثة ملليلتر من ABM-ناقص قبل الدافئة إلى كل بئر.
باستخدام ملقط العقيمة، والتعامل مع إدراج لتجاهل بعناية الوسيطة كاملة endothelial من جانب الدم، ووضع إدراج في لوحة جديدة تحتوي على ABM ناقص. ثم، إضافة 2.5 ملليلتر من EBM-ناقص. اترك التعديلات في الحاضنة مع الحد الأدنى من الاضطراب البدني أو تغير درجة الحرارة لمدة خمسة أيام.
في يوم النقل، استبدل الوسيط. للتصوير المناعي، ضع ما يصل إلى أربعة أغطية بوروسيليكات معقمة مستديرة في كل بئر من لوحة سداسية جيدا تحتوي على مليلترين من بولي-د-ليسين. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
وفي الوقت نفسه، استخدم ماصة مصلية معقمة لنقل مجالات الورم بعناية من وعاء ثقافة الخلية إلى أنبوب معقمة 15 ملليلتر. الطرد المركزي في مجالات الورم في 250 مرات ز لمدة ثلاث دقائق. تجاهل supernatant، وبلطف resuspend المجالات في ملليلتر واحد من GBM-ناقص.
عد الخلايا، وضبط كثافة الخلية إلى حوالي 10000 مجال أو 100000 خلية لكل ملليلتر من GBM-ناقص. بعد ذلك ، تخلص من البولي - D - ليسين من الآبار ، وشطف الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني عقيم. بذور كل بئر من لوحة مع ثلاثة ملليلترات من تعليق الورم spheroid، ونقل إدراج مع BBTB تقليد على تعليق الخلايا الورم.
احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح للدم والجوانب ورم الدماغ من مقايسة أن يأتي إلى التوازن. في اليوم التالي، استبدل وسائل الإعلام في جانب الدم بـ EBM-ناقص مكمّلة بالجزيئات أو الأدوية أو الجسيمات النانوية ذات الأهمية. جمع العينات مع مرور الوقت للحصول على التحديد الكمي المباشر كما سبق وصفه.
أولاً، جمع 100 ميكرولترات من المتوسط من جانبي الدم والدماغ من تقليد BBTB، ونقل كل منها إلى لوحة منفصلة مسطحة القاع، سوداء، 96-well لقياسات الفلورس اللاحقة. المقبل, إعداد محلول 50 ميكرومولار من فلوريسين الصوديوم في EBM ناقص, التأكد من إعداد 2.5 ملليلتر في البئر. قبل الدافئة هذا الحل إلى 37 درجة مئوية، واستبدال وسائل الإعلام من جانب الدم من إدراج مع وسائل الإعلام التي تحتوي على هذا الحل الفلوريسين الصوديوم.
بدء مؤقت بمجرد استبدال الوسيطة. جمع بعناية 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام من الجانبين الدم والدماغ من إدراج في خمس دقائق، 30 دقيقة، 60 دقيقة، و 120 دقيقة. نقل كل عينة إلى آبار منفصلة من لوحة سوداء مناسبة، 96-well.
استخدم قارئ لوحة لقياس الفلوريسنس من العينات التي تم جمعها. أولاً، تمييع صبغة الفلورسنت الليسوسوم إلى تركيز العمل المناسب في الوسط الذي تم تسخينه مسبقًا. إضافة هذا إلى الخلايا، واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 45 دقيقة.
ثم، شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. تجاهل برنامج تلفزيوني، وإضافة ثلاثة ملليلتر من الجليد الباردة 4٪ شبه شكلي إلى الآبار و 2.5 ملليلتر إلى إدراج. احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك، تجاهل شبهformaldehyde، وشطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني، و counterstain الخلايا النوى باستخدام محلول DAPI في تركيز النهائي من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر في الماء المقطر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع دقائق.
ثم، إزالة DAPI، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع الماء المقطر. قطع بعناية الغشاء، وإزالة الماء المقطر، ووضعها على قطرة من المتوسطة تصاعد على شريحة المجهر الزجاجي. إضافة قطرة أخرى من المتوسط تصاعد على الجانب الآخر من الغشاء، وتغطي بعناية مع زجاج غطاء البورسليكات.
في هذه الدراسة، كانت الخلايا البطانية تشارك في الثقافة مع الخلايا الفلكية لتشكيل واجهة تشبه حاجز ورم الدم في الدماغ في إعداد المختبر. تصوير Confocal من تقليد مورين BBTB يظهر التعبير والتعريب الخلوي للبروتينات تقاطع ضيق zonula occludens-1 وكلاودن-5 في bEND3. الاتصالات بين الخلايا البطانية والخلايا الفلكية يدفع بوضوح نقل هذين البروتينين إلى الاتصالات من الخلايا إلى الخلية البطانية مقارنة بزراعة أحادية bEND3.
باستخدام تلطيخ الفلوروسين المناعية لتصور الخلايا الفلكية المعبرة عن GFAP في جانب الدماغ من الغشاء ، فمن الممكن مراقبة ودراسة العمليات الفلكية ونهاية القدمين الاتصال بالخلايا البطانية من خلال الغشاء. لمقارنة قيم نفاذية BBTB في المختبر يحاكي مع حاجز الدم في الدماغ في المختبر، يتم تصوير انتشار في الوقت الحقيقي من فلوريسين الصوديوم من خلال نافذة الجمجمة المزروعة في الفئران عارية. باستخدام المجهر ستيريو fluorescence، يتم تسجيل انتشار الفلورسين الصوديوم من الشعيرات الدموية الأوعية الدموية المستمدة من الأوعية الدموية الرئيسية البزى قبل وأثناء وبعد الحقن الجهازي للتحقيق.
ثم تتم مقارنة transcytosis من الجسيمات النانوية التي تستهدف مجالات الورم الأرومي الدبقي المستمدة من المريض لتوضيح كيف يمكن استخدام هذا محاكاة BBTB لتصور مرور المركبات من جانب الدم إلى جانب الدماغ. تُترجم الإشارة الفلورية المرتبطة بـ NP110 مع الليسوسومات في الخلايا البطانية، والخلايا الفلكية، والخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم اكتشاف NP110s بين الخلايا البطانية والخلايا الفلكية ، وتمر عبر مسام الغشاء من إدراج.
يتم قياس مرور NP110s من خلال قياس الفلوريس من العينات التي تم جمعها من جانب الدم والدماغ على حد سواء، ويتم مقارنة هذه القيم مع تلك الجسيمات النانوية المحددة التي هي 350 نانومتر. كما يمكن أن نرى، فقط NP110s قادرة على عبور محاكاة BBTB، في حين بقي NP350 على جانب الدم، مما أدى إلى انخفاض قيم نفاذية لهذه الجسيمات النانوية. التعامل مع إدراج بعناية، وانتشار بحذر تعليق الخلايا الفلكية على الجانب الدماغ من إدراج دون اتصال مباشر للغشاء.
أي ضرر للغشاء سيؤدي إلى تسرب. ويمكن تكييف هذه الطريقة للرد على السؤال المتعلق بتسليم الدماغ للحمولات المدارة على نحو هامشي. باستخدام إدراج مختلفة مع المسام الغشاء أكبر, فمن الممكن أيضا لدراسة البذخ الخلية.
يمكن تعديل هذه التقنية باستخدام أنواع مختلفة من الخلايا لمحاكاة الحواجز الخلوية الأخرى. كما أنه يمهد الطريق لإجراء أبحاث أكثر مسؤولية وأخلاقية، تهدف إلى تقليل عدد الحيوانات المختبرية المستخدمة في التحقق من صحة الأدوية المضادة للسرطان. يرجى تذكر أن مادة ما قبلاالدهيد مادة كيميائية سامة جدا وينبغي التعامل معها وفقا لذلك.
أيضا، كن حذرا أثناء استخدام مشرط حاد لاستخراج الأغشية من إدراج.
