هذا البروتوكول تفاصيل استخدام جهاز تحديد المواقع للتسليم داخل الأنف من الجزيئات الحيوية إلى الجهاز العصبي المركزي للماوس. استخدام هذا الجهاز يقلل بشكل كبير من التعامل مع الفئران ووقت العلاج مما يؤدي إلى تحسين الكفاءة وإعادة إنتاج هذه التقنية. لبدء هذا الإجراء، وتقييم مستوى التخدير من الفئران من قبل دواسة منعكس من أجل الحفاظ على الطائرة الجراحية.
بعد ذلك، ضع جهاز تحديد المواقع على مسافة مناسبة وارتفاع للسماح بالوصول المريح إلى جميع الكواشف المطلوبة. ثم، وتطبيق مرهم على عيون الحيوان. حزام ماوس واحد مع أحزمة كرسي، والتأكد من أن الأمامية الماوس توفير الدعم الطبيعي في حين أنها في وضع مريح دون أي إزعاج.
كرر الإجراءات الخاصة بالفئران المتبقية. ضع كل فأرة بلطف على الكرسي المعين من خلال وضع ظهرها الموازي لدعم الظهيرين للكرسي وعلى درجة 90 إلى مقعد الكرسي. السماح للحيوان تقع بشكل طبيعي في الرأس إلى أسفل وإلى الأمام الموقف دون دفع أو الضغط.
مرة واحدة يتم ربط جميع الفئران، على الفور بدء التطعيم داخل الأنف. لتنفيذ التسليم داخل الأنف، تحميل micropipette مع اثنين microliters من RVG9R حل معقد سيرنا. عقد ماصة في اليد المهيمنة ودعمها مع ناحية أخرى لتجنب الحركات غير المنضبط في حين إدارة سيرنا.
مكان حول اثنين من قطرات ميكرولتر قريبة جدا من أنف واحد بحيث يمكن الماوس استنشاقه مباشرة. إذا لم يتم تشكيل قطرة صغيرة بسهولة، استبدل طرف الماصات بأخرى جديدة وكرر العملية. دفع بلطف رأس الماوس إلى أسفل مع السبابة لمدة خمس ثوان في حين أنه يتم استنشاق والحفاظ على الموقف.
لمنع تصريف المخدرات في الرئتين من المهم أن تدفع بوقد رأس الماوس إلى أسفل مع السبابة لمدة خمس ثوان بينما الماوس هو استنشاق. بدء ساعة توقيت على مدار الساعة ثلاث إلى أربع دقائق بعد هذا إلى وقت التطعيم في ناري الثاني من الفأرة الأولى. هذا الفاصل الزمني ضروري للماوس لاستكمال استنشاق الجرعة الأولى واستعادة التنفس الطبيعي.
في الفاصل الزمني من ثلاث إلى أربع دقائق بين تلقيح ناريس بديل على الفأرة الأولى ، يتم التطعيم داخل الأنف من نار واحدة في كل من الفئران الثلاثة المتبقية الموضوعة على الجهاز. عندما تبدو ساعة الإيقاف، تلقيح الخياشيم الثاني على الماوس الأول وكرر الإجراء الخاص بالماوس الأخرى كما هو أعلى. كرر الإجراء حتى يتم تسليم 20 إلى 30 ميكرولترات لجميع الفئران الأربعة.
وسوف يستغرق حوالي 30 إلى 45 دقيقة لإكمال إجراء التلقيح بأكمله. إعادة الحيوانات مرة أخرى إلى أقفاصهم المعينة. لا تترك الفئران دون مراقبة حتى أنها استعادت الوعي الكافي للحفاظ على إعادة شغل صارمة.
لتقييم إسكات الجينات، واستخراج RNA من مناطق الدماغ المختلفة مع عدة تنقية الحمض النووي الريبي، والنسخ العكسي في cDNA باستخدام مجموعة التوليف cDNA، وتنفيذ qPCR مع أزواج التمهيدي. تم اختبار معظم تسليم الدماغ من الببتيد RVG9R المسمى مع فلور اليكسا 488 لأول مرة باستخدام جهاز تحديد المواقع الماوس الموصوفة هنا. في 48 ساعة بعد تلقيح, تم استئصال مختلف الأجهزة لقياس A488 fluorescence.
لم يتم الكشف عن أي شيء في أي من الأجهزة في الضوابط السلبية. من ناحية أخرى، تم الكشف عن إشارة فلورية قوية A488 حصرا في أدمغة المجموعة تلقيح RVG9R. وبالإضافة إلى ذلك، تمت مقارنة موضع الماوس إلى طريقة موقف ضعيف وطريقة مستيقظا للفعالية.
وأشارت النتائج إلى أن وضع الفئران رئيس لأسفل وإلى الأمام تحسين البينة وترسب RVG9R A488 في جميع أنحاء أنسجة الدماغ. لمزيد من تأكيد تسليم سيرنا إلى الدماغ، تم إجراء مسح كامل للدماغ بعد إدارة واحدة داخل الأنف من RVG9R معقدة لCy5 المسمى سيرنا. على النقيض من برنامج تلفزيوني أو RVM9R، أدى التعقيد مع RVG9R إلى تراكم قوي من سيرنا في مناطق الدماغ الرئيسية بما في ذلك لمبة الشم، القشرة، قرن آمون، المهاد، تحت المهاد، منتصف الدماغ، والمخيخ.
ويمكن استخدام جهاز تحديد المواقع لتسليم الأدوية أو الجزيئات إلى الماوس CNS. وتمتد التطبيقات إلى اختبار العلاجات وكذلك فحص الآليات الخلوية في الجهاز العصبي المركزي. وقد استخدم المحققون جهاز تحديد المواقع هذا للتدليل على فاعلية الـ(سيرنا) في علاج مرض فيروس غرب النيل، فضلاً عن استكشاف العلاجات لأمراض الجهاز العصبي المركزي الأخرى.
