الهدف العام لهذا الإجراء هو تنقية الريبوسومات من الميتوكوندريا من خطوط الخلايا البشرية على نطاق واسع يكفي للدراسات الهيكلية. هذه الطريقة تنقية الريبوسوم الميتوكوندريا تمكن من توصيف المجمعات المترجمة، المسوخ، جمعيات مراقبة الجودة، والمتوسطات الوحدة الفرعية الميتوسيبوسكال. ويمكن استخدام هذه للإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تخليق البروتين في الميتوكوندريا.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التجويف النيتروجيني يستخدم لتحلل الخلايا وهناك حاجة فقط إلى 10 خلايا الثقافة لإعداد mitoribosomes لتحديد بنية عالية الدقة. يمكن أن يؤدي هذا الأسلوب في اكتشاف مكونات جديدة من آلات ترجمة الميتوكوندريا ويمكن استخدامها كذلك لتطوير علاجات جديدة لعلاج السرطان. بعد زراعة خلايا HEK293S وفقا لبروتوكول النص، حصاد اثنين من أنابيب لتر واحد من الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1، 000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة سبع دقائق.
بعناية طهر من عظمى وسرعة resuspend كل بيليه في 100 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم تجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في تعليق 1، 200 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. المقبل ، بعد اطهر بعناية من افرا ، وزن بيليه.
ثم، استخدم 120 ملليلتر من المخزن المؤقت MIB لإعادة تعليقها وترك الخلايا التي تم إيقافها لتنتفخ في الغرفة الباردة لمدة 20 دقيقة. نقل الخلايا المنتفخة إلى غرفة التجويف النيتروجينية قبل التبريد على الجليد. ثم، إضافة 45 ملليلتر من المخزن المؤقت SM4 إلى الخلايا.
قم بربط غرفة التجويف النيتروجيني وملئها بالنيتروجين حتى يصل الضغط إلى 500 PSI. ثم، أغلق الصنابير وابقيها على الجليد لمدة 20 دقيقة. تمنع طريقة تحلل خلايا التجويف النيتروجيني الضغط البدني الخارجي على الخلايا ، وتتجنب تلف الحرارة في العضيات ، ويحمي غاز النيتروجين الخلايا من الأكسدة.
بالإضافة إلى ذلك، إنها طريقة قابلة للاستنساخ للغاية. الإفراج ببطء الضغط في الغرفة وجمع lysate. ثم، لإزالة حطام الخلية والنوى، الطرد المركزي المواد lysed في 800 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
جمع عظمى عن طريق صب من خلال قطعة مطوية من القماش الموسلين في منقار أبقى على الجليد. لا تتخلى عن البيليه. Resuspend بيليه في 90 ملليلتر من العازلة MiBSM.
ثم، باستخدام الزجاج تفلون أسفل التجانس، التجانس العينة وتكرار الطرد المركزي في 800 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. مرة أخرى، وجمع الماكر عن طريق صب من خلال قطعة مطوية من القماش الموسلين في منقار أبقى على الجليد. ثم، الجمع بين هذا مُتطّر مع المُتَبّع الأول.
أجهزة الطرد المركزي العينة في 1،000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم، وجمع الماسخ كما كان من قبل. بعد التخلص من بيليه، الطرد المركزي الماحتَج الذي يحتوي على الميتوكوندريا الخام في 10، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
غسل بعناية أي بيليه فضفاضة دون إزعاج الجزء ضيق. ثم, استخدام 10 ملليلتر من العازلة MiBSM لإعادة تعليق بيليه ضيق. إضافة 200 وحدة من RNase-الخالية من DNase إلى العينة لإزالة الحمض النووي الجينومي وتدوير الأنبوب على الأسطوانة في غرفة باردة لمدة 20 دقيقة لهضم العينة بالتساوي.
الطرد المركزي العينة في 10، 000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة واستخدام مليلتر اثنين من العازلة SEM لإعادة تعليق بيليه. قم بتحميل نظام التعليق الميتوكوندريا بالكامل فوق تدرج السكروز. بعد الغزل التدرج وفقا لبروتوكول النص، وذلك باستخدام ماصة نقل، وجمع بعناية الفرقة البني المهاجرة في واجهة 32٪ و 60٪ السكروز.
يستخدم هذا البروتوكول التجويف النيتروجيني لكسر الخلايا. مرة واحدة يتقن, يمكن أن يتم عزل واسعة النطاق من الميتوكوندريا نقية للغاية, سليمة في غضون تسع ساعات ويمكن بسهولة تعديل وتكييفها لأنواع الخلايا المختلفة والمقاييس. بعد إزالة الجليد الميتوكوندريا المجمدة على الجليد، إضافة اثنين من وحدات التخزين المؤقت إلى ثلاثة ملليلتر من الميتوكوندريا.
تخلط على الفور عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. استخدام الزجاج تفلون صغيرة أسفل التجانس للمساعدة مع التحلل واحتضان التجانس على الجليد لمدة خمس إلى 10 دقائق لإكمال رد الفعل. الطرد المركزي في 30، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لإزالة المواد غير قابلة للذوبان.
ثم، جمع بعناية فائقة وتجاهل بيليه. كرر الطرد المركزي لضمان توضيح من عظمى. ثم، جمع بعناية فائقة وتجاهل بيليه.
لكل ملليلتر من المواد lysed، وإعداد وسادة السكروز في أنبوب TLA-120.2 واضحة جدا عن طريق إضافة 0.4 ملليلتر من وسادة السكروز إلى الأنابيب. طبقة ما يقرب من ملليلتر واحد من الميتوكوندريا lysed على كل وسادة السكروز مما أدى إلى نسبة lysate إلى وسادة من 2.5 إلى واحد. ثم، الطرد المركزي العينة في TLA-120.2 الدوار في 231، 550 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة.
تجاهل supernatant واستخدام 100 ميكرولترات من العازلة resuspension لشطف الأنبوب وإزالة السكروز المتبقية. إعادة تعليق الكريات والجمع بينها في ما مجموعه 100 ميكرولترات من عازلة resuspension. في حين resuspending بيليه وسادة، فمن الضروري أن تؤدي على الجليد لتجنب تسخين العينة وأيضا لتجنب رغوة العينة من أجل ضمان السلامة الهيكلية للريبوسوم الميتوكوندريا.
دوامة العينة على سرعة بطيئة لمدة 30 ثانية إلى حل المجاميع المتبقية وأجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 17، 949 مرات ز و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. جمع بعناية عظمى وتكرار الطرد المركزي. بعد قياس الامتصاص الميتوريبوب في A260، تحميل العينة بأكملها على أنبوب تدرج السكروز خطية واحدة.
أجهزة الطرد المركزي العينة في دوار TLS-55 في 213، 626 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 120 دقيقة. لكسر التدرج ، وثقب الجزء السفلي من الأنبوب وجمع عينة قطرة الحكمة في لوحة 96 جيدا. وينبغي أن تنقية ميتوريبوبوس لا يستغرق أكثر من سبع ساعات لكمية كافية من mitoribosomes.
كما هو موضح في هذا التدرج السكروز متقطع، mitochondria تنقية تهاجر إلى الفرقة السفلي البني في واجهة 32-60٪. بعد فصل المتوريبومات من مجمعات الميتوكوندريا القابلة للذوبان على تدرج السكروز ، يتم تحديد اثنين من المجموعات الميتوريبوسومية الرئيسية ، 55S أحادية اللون وununit 39S كبيرة. يشير وجود كسر الوحدات الفرعية الكبيرة إلى أن الخلايا يتم حصادها في حالة تقسيم نشطة.
تُظهر هذه اللوحة ميكروجراف مع العينة من ذروة أحادية اللون في تكبير محسوب يبلغ 1.23 انجستروم لكل بكسل. تظهر هنا بيانات بعد المعالجة الأولية التي تكشف عن monosomes سليمة. وأخيراً، يتم توضيح إعادة بناء ثلاثية الأبعاد أحادية الأبعاد في هذه اللوحة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد الميتوريوبوسومات البشرية سليمة للدراسات الهيكلية والبيوكيميائية. يقدم بروتوكولنا تحضيرات نهائية عالية الجودة يمكن استقراءها للجزيئات الميتوكوندرية الأخرى.
