이 절차의 전반적인 목표는 구조 적인 연구를 위해 충분한 대규모로 인간 세포주의 미토콘드리아에서 리보솜을 정화하는 것입니다. 이 미토콘드리아 리보솜 정제 방법은 복합체, 돌연변이, 품질 관리 어셈블리 및 미토리보소말 서브유닛 중급체를 번역하는 특성화를 가능하게 한다. 이들은 미토콘드리아에 있는 단백질 종합에 관하여 중요한 질문에 대답하기 위하여 이용될 수 있습니다.
이 기술의 주요 장점은 질소 캐비테이션이 세포 용해에 사용되며 10 대 배양 세포만이 고해상도 구조 결정을 위해 미토리보좀을 준비하는 데 필요하다는 것입니다. 이 기술은 미토콘드리아 번역 기계의 새로운 성분의 발견귀착될 수 있고 암 처리를 위한 새로운 치료법의 발달을 위해 더 이용될 수 있다. 텍스트 프로토콜에 따라 HEK293S 세포를 배양한 후, 7분 동안 1, 000배, 섭씨 4도에서 원심분리로 2리터의 세포를 수확한다.
신중하게 슈퍼 네티미터를 장식하고 신속하게 PBS의 100 밀리리터에서 각 펠릿을 다시 중단. 그런 다음, 세포를 풀과 원심 분리는 1, 200 배 g와 10 분 동안 섭씨 4도에서 서스펜션을 원심분리합니다. 다음으로, 신중하게 상체를 탈수 한 후, 펠릿의 무게.
그런 다음 MIB 버퍼 120 밀리리터를 사용하여 다시 중단하고 다시 중단된 셀을 20분 동안 차가운 방에서 팽창시둡니다. 팽창된 세포를 얼음 위에 미리 냉각된 질소 캐비테이션 챔버로 옮기습니다. 그런 다음 셀에 45밀리리터의 SM4 버퍼를 추가합니다.
질소 캐비테이션 챔버를 고정하고 압력이 500 PSI에 도달 할 때까지 질소로 채웁니다. 그런 다음 탭을 닫고 20 분 동안 얼음위에 보관하십시오. 질소 캐비테이션 세포 용해 방법은 세포에 대한 외부 물리적 스트레스를 방지하고, 세포에 대한 열 손상을 방지하며, 질소 가스가 산화로부터 세포를 보호합니다.
또한, 그것은 매우 재현 가능한 방법입니다. 천천히 챔버에 압력을 해제하고 lysate을 수집합니다. 이어서, 세포 파편과 핵을 제거하기 위해, 10분 동안 800배 g및 섭씨 4도에서 리세드 물질을 원심분리한다.
접힌 모슬린 천을 얼음 위에 보관한 비커에 부어 상체를 수집합니다. 펠릿을 버리지 마십시오. MiBSM 버퍼의 90 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
그런 다음, 테플론 유리를 사용하여 균질화제를 사용하여 샘플을 균질화하고 원심분리를 800배, 섭씨 4도에서 10분 동안 반복한다. 다시 한 번, 얼음 위에 보관된 비커에 접힌 모슬린 천 조각을 부어 상체를 수집합니다. 그런 다음이 상체와 첫 번째 상수와 결합합니다.
15분 동안 1, 000배, 섭씨 4도에서 샘플을 원심분리합니다. 그런 다음, 이전과 같이 상체를 수집합니다. 펠릿을 버린 후, 원심분리기는 10, 000배, 섭씨 4도에서 10, 000배, 섭씨 4도에 함유된 상피를 15분간 분리한다.
단단한 부분을 방해하지 않고 느슨한 펠릿을 조심스럽게 씻어 내십시오. 그런 다음 MiBSM 버퍼 10 밀리리터를 사용하여 단단한 펠릿을 다시 일시 중지합니다. 200단위의 RNase-Free DNase를 샘플에 추가하여 게놈 DNA를 제거하고 차가운 방에서 롤러에 튜브를 회전하여 샘플을 균등하게 소화합니다.
원심 분리는 15 분 동안 10, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 샘플을 원심분리하고 펠릿을 다시 중단하기 위해 SEM 버퍼의 2 밀리리터를 사용합니다. 자당 그라데이션 위에 전체 미토콘드리아 서스펜션을 적재합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 그라데이션을 회전한 후, 전송 파이펫을 사용하여 32%와 60%의 자당 인터페이스에서 마이그레이션되는 갈색 대역을 조심스럽게 수집합니다.
이 프로토콜은 질소 캐비테이션을 사용하여 세포를 분해합니다. 일단 마스터되면, 고순수하고 손상되지 않은 미토콘드리아의 대규모 격리는 9 시간 이내에 수행 할 수 있으며 다른 세포 유형및 비늘에 쉽게 수정하고 적응 할 수 있습니다. 얼음에 냉동 미토콘드리아를 해동 한 후, 미토콘드리아의 세 밀리리터에 2 볼륨의 리시스 버퍼를 추가합니다.
튜브를 여러 번 반전시켜 즉시 섞는다. 작은 테플론 유리를 사용하여 용해를 돕고 얼음에 동형어를 배양하여 5~10분 동안 반응완료하십시오. 용해물 30, 000배, 섭씨 4도에서 20분간 용해성 물질을 제거합니다.
그런 다음, 신중하게 상체를 수집하고 펠릿을 폐기합니다. 상체의 명확성을 보장하기 위해 원심 분리를 반복합니다. 그런 다음, 신중하게 상체를 수집하고 펠릿을 폐기합니다.
용액 재료의 모든 밀리리터에 대해, 튜브에 0.4 밀리리터의 자당 쿠션을 추가하여 TLA-120.2 초투명 튜브에 자당 쿠션을 준비하십시오. 용액미토콘드리아의 약 1밀리리터를 각 자당 쿠션에 겹쳐서 2.5 대 1의 용액 대 쿠션 비율을 생성합니다. 이어서, TLA-120.2 로터에서 샘플을 231, 550배, 섭씨 45분 동안 원심분리한다.
상체를 버리고 재서스펜션 버퍼의 100 마이크로리터를 사용하여 튜브를 헹구고 잔류 자당을 제거하십시오. 펠릿을 다시 중단하고 총 100 마이크로리터의 재서스펜션 버퍼로 결합합니다. 쿠션 펠릿을 재차 스펜싱하는 동안, 시료의 가열을 피하고 미토콘드리아 리보좀의 구조적 무결성을 보장하기 위해 시료의 발포를 피하기 위해 얼음에서 수행하는 것이 필수적입니다.
30초 동안 느린 속도로 샘플을 소용돌이쳐 남은 골재를 용해시키고 튜브를 17, 949배, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상체를 조심스럽게 수집하고 원심 분리를 반복합니다. A260에서 미토리보솜 흡수를 측정한 후 전체 샘플을 단일 선형 자당 그라데이션 튜브에 적재합니다.
원심 분리는 TLS-55 로터에서 샘플을 213, 626 배 g 및 섭씨 4도에서 120 분 동안 분리합니다. 그라데이션을 분수하기 위해 튜브의 바닥을 뚫고 96웰 플레이트에서 시료 드롭 와이즈를 수집합니다. 미토리보솜 정제는 충분한 양의 미토리보좀을 위해 7시간 이상 걸리지 않아야 합니다.
이 불연속 자당 그라데이션에서 입증된 바와 같이, 정제된 미토콘드리아는 32-60%의 인터페이스에서 갈색 하부 밴드로 이동한다. 자당 그라데이션에 수용성 미토콘드리아 복합체에서 미토리보좀을 분리한 후, 2개의 주요 미토리보소말 집단이 확인되고, 단조55S 및 대형 서브유닛 39S. 큰 서브유닛 분획의 존재는 세포가 적극적으로 분할된 상태에서 수확된다는 것을 시사한다.
이 패널은 픽셀당 1.23 angstroms의 보정 배율에서 모노솜 피크 2의 샘플이 있는 현미경 그래프를 보여줍니다. 여기에 는 그대로 단조로운 것을 드러내는 초기 처리 후의 데이터가 표시됩니다. 마지막으로, 단조로운 3D 재구성이 패널에 설명되어 있습니다.
이 비디오를 시청 한 후, 당신은 구조 및 생화학 연구에 대한 그대로 인간의 미토리보좀을 준비하는 방법에 대한 좋은 이해를해야합니다. 우리의 프로토콜은 다른 미토콘드리아 거대 분자에 추정 될 수있는 고품질최종 준비를 제공합니다.
