O objetivo geral deste procedimento é purificar ribossomos de mitocôndrias de linhas celulares humanas em larga escala que são suficientes para estudos estruturais. Este método de purificação ribossomista mitocondrial permite a caracterização de complexos de tradução, mutantes, conjuntos de controle de qualidade e intermediários de subunidade mitoribosomal. Estes podem ser usados para responder a perguntas-chave sobre a síntese de proteínas nas mitocôndrias.
A principal vantagem dessa técnica é que a cavitação de nitrogênio é usada para a lise celular e apenas 10 a 10 células de cultura são necessárias para preparar mitoribosomes para determinação da estrutura de alta resolução. Essa técnica pode resultar na descoberta de novos componentes da máquina de tradução mitocôndrias e pode ser ainda mais utilizada para o desenvolvimento de novas terapêuticas para o tratamento do câncer. Depois de esculpir células HEK293S de acordo com o protocolo de texto, colde dois tubos de um litro de células por centrifugação a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius por sete minutos.
Decante cuidadosamente o supernasce e resuspense rapidamente cada pelota em 100 mililitros de PBS. Em seguida, acumule as células e centrifugar a suspensão em 1.200 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, depois de decantar cuidadosamente o supernante, pese a pelota.
Em seguida, use 120 mililitros de tampão MIB para resuspendá-lo e deixar as células resuspended para inchar na sala fria por 20 minutos. Transfira as células inchadas para uma câmara de cavitação de nitrogênio pré-resfriada no gelo. Em seguida, adicione 45 mililitros de tampão SM4 às células.
Aperte a câmara de cavitação de nitrogênio e encha-a com nitrogênio até que a pressão atinja 500 PSI. Em seguida, feche as torneiras e mantenha-a no gelo por 20 minutos. O método de lise celular de cavitação de nitrogênio previne o estresse físico externo nas células, evita danos térmicos às organelas, e o gás nitrogênio protege as células da oxidação.
Além disso, é um método altamente reprodutível. Solte lentamente a pressão na câmara e colete o lysate. Em seguida, para remover os detritos celulares e núcleos, centrifugar o material líssecido a 800 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos.
Colete o supernatante despejando-o através de um pedaço dobrado de pano de musselina em um béquer mantido no gelo. Não descarte a pelota. Resuspende a pelota em 90 mililitros de tampão MiBSM.
Em seguida, utilizando um vidro Teflon para baixo homogeneizador, homogeneize a amostra e repita a centrifugação a 800 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Mais uma vez, colecione o supernatante derramando-o através de um pedaço dobrado de pano de musselina em um béquer mantido no gelo. Então, combine este supernatante com o primeiro supernatante.
Centrifugar a amostra a 1.000 vezes g e quatro graus celsius por 15 minutos. Então, recolha o supernatante como antes. Depois de descartar a pelota, centrifugar o supernacante contendo mitocôndrias brutas a 10.000 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos.
Lave cuidadosamente qualquer pelota solta sem perturbar a porção apertada. Em seguida, use 10 mililitros de tampão MiBSM para resuspensar a pelota apertada. Adicione 200 unidades de DNase livre de RNase à amostra para remover o DNA genômico e girar o tubo em um rolo na sala fria por 20 minutos para digerir uniformemente a amostra.
Centrifugar a amostra a 10.000 vezes g e quatro graus celsius por 15 minutos e usar dois mililitros de tampão SEM para resuspensar a pelota. Carregue toda a suspensão mitocondrial em cima do gradiente de sacarose. Depois de girar o gradiente de acordo com o protocolo de texto, usando uma pipeta de transferência, colete cuidadosamente a faixa marrom migrando na interface de 32% e 60% de sacarose.
Este protocolo usa cavitação de nitrogênio para quebrar as células. Uma vez dominado, um isolamento em larga escala de mitocôndrias altamente puras e intactas pode ser feito dentro de nove horas e pode ser facilmente modificado e adaptado para diferentes tipos e escalas de células. Depois de descongelar mitocôndrias congeladas no gelo, adicione dois volumes de tampão de lise a três mililitros de mitocôndrias.
Misture imediatamente invertendo o tubo várias vezes. Use um pequeno vidro Teflon para baixo homogeneizador para ajudar com a lise e incubar o homogeneizado no gelo por cinco a 10 minutos para completar a reação. Centrifugar o lise a 30.000 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos para remover o material insolúvel.
Em seguida, colecione cuidadosamente o supernasce e descarte a pelota. Repita a centrifugação para garantir o esclarecimento do supernatante. Em seguida, colecione cuidadosamente o supernasce e descarte a pelota.
Para cada mililitro de material lysed, prepare uma almofada de sacarose em um tubo ultra claro TLA-120.2 adicionando 0,4 mililitros de almofada de sacarose aos tubos. Camada aproximadamente um mililitro de mitocôndrias líssedas em cada almofada de sacarose resultando em uma relação lysate-cushion de 2,5 para um. Em seguida, centrifugar a amostra em um rotor TLA-120.2 a 231, 550 vezes g e quatro graus Celsius por 45 minutos.
Descarte o supernatante e use 100 microliters do tampão de ressuspensão para enxaguar o tubo e remover sacarose residual. Resuspense as pelotas e combine-as em um total de 100 microliters de tampão de resuspensão. Enquanto ressumem a pelota da almofada, é essencial realizar no gelo para evitar o aquecimento da amostra e também evitar espuma da amostra, a fim de garantir a integridade estrutural dos ribossomos mitocondrial.
Vórtice a amostra em velocidade lenta por 30 segundos para dissolver os agregados restantes e centrifugar os tubos a 17.949 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Colete cuidadosamente o supernatante e repita a centrifugação. Depois de medir a absorção mitoribosome em A260, carregue toda a amostra em um único tubo linear de gradiente de sacarose.
Centrifugar a amostra em um rotor TLS-55 a 213, 626 vezes g e quatro graus Celsius por 120 minutos. Para fracionar o gradiente, puna a parte inferior do tubo e colete a amostra em uma placa de 96 poços. A purificação mitoribosome não deve levar mais de sete horas para uma quantidade suficiente de mitoribosomes.
Como demonstrado neste gradiente de sacarose descontínuo, as mitocôndrias purificadas migram para a faixa inferior marrom na interface 32-60%. Após a separação de mitoribosomes de complexos mitocondriais solúveis em um gradiente de sacarose, duas grandes populações mitoribosomais são identificadas, a monosome 55S e a subunidade grande 39S. A presença da grande fração de subunidade sugere que as células são colhidas em um estado ativamente divisória.
Este painel mostra um micrografo com a amostra do pico monosome dois em uma ampliação calibrada de 1,23 angstroms por pixel. Aqui estão dados após o processamento inicial revelando monossomos intactos. Finalmente, uma reconstrução 3D monossódia é ilustrada neste painel.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar mitoribosomes humanos intactos para estudos estruturais e bioquímicos. Nosso protocolo oferece preparações finais de alta qualidade que poderiam ser extrapoladas para outras macromoléculas mitocondriais.
