لقد قمنا بتحسين طريقة ريبوتتاج المنشورة سابقا للحد بشكل كبير من الخلفية. وهذا يجعل التطبيق على نماذج معقدة مثل نظام متحولة أبسط من منظور تحليل وأقل تكلفة بكثير. وبصرف النظر عن جيل الحيوانات التجريبية, طريقة ريبوتاج هو أسهل بكثير وأكثر مباشرة من الطرق الأخرى لتحليل الريبوسومات المرتبطة.
مثل جميع التجارب الجيش الملكي النيبالي، والشروط الصارمة RNase الحرة هي أساسية للنجاح. إذا كان لديك خبرة محدودة مع RNA، تحقق من الظروف الخاصة بك عن طريق إجراء استخراج الحمض النووي الريبي الأساسية أولا ثم الانتقال. ومن خلال هذا الإجراء، ستكون لورين شكر الله، طالبة دراسات عليا من مختبري.
لإعداد العازلة التجانس، إضافة 2.5 ملليلتر من تريس مولر واحد في 7.4 pH، وخمسة ملليلتر من كلوريد البوتاسيوم مولار واحد، 600 ميكرولترات من كلوريد المغنيسيوم مولار واحد، و 500 ميكرولتر من MP40 إلى أنبوب 50 ملليلتر. إضافة ديثيل بيريوكاربوات المعالجة بالماء إلى الأنبوب لجعل حجم إلى 50 ملليلتر ومزيج حتى يتم دمج جميع المكونات. لإعداد العازلة غسل عالية الملح، إضافة 2.5 ملليلتر من تريس مولر واحد في درجة الH 7.4، 15 ملليلتر من كلوريد البوتاسيوم مولار واحد، 600 ميكرولترات من كلوريد المغنيسيوم مولار واحد، و 500 ميكرولتر من MP40 إلى أنبوب 50 ملليلتر.
جعله حجم 50 ملليلتر في المياه المعالجة بيريوكاربونات دييثيل ومزيج حتى يتم دمج جميع المكونات. قبل وزن جميع الأنابيب عينة، وتسجيل الوزن، وpre-cool في النيتروجين السائل. قبل التبريد قذائف هاون معقمة، والآفات، وملعقة وزنها على الجليد الجاف.
ثم على الجليد الجاف، واستخدام قذائف الهاون العقيمة قبل التبريد و pestle لكسر عينات فلاش الأنسجة المجمدة في قطع كبيرة وطحن ببطء في مسحوق ناعم. باستخدام ملعقة ما قبل التبريد، كشط مسحوق من قذائف الهاون إلى أنبوب جمع قبل التبريد مع الحرص على الحفاظ على الجليد الجاف كلما كان ذلك ممكنا. وزن الأنبوب مع مسحوق الأنسجة.
حساب كتلة الأنسجة عن طريق طرح الوزن الأولي للأنبوب من وزن الأنبوب مع العينة فيه. تسجيل هذه القيمة لحساب لاحق وحدات التخزين المؤقت lysis. إعداد العازلة تحلل عن طريق إضافة إلى 10 ملليلتر من التجانس العازلة dithiothreitl, مثبط RNase, Cycloheximide, الهيبارين, واحد حبوب مثبطات البروتياز.
تخلط حتى يتم دمج جميع المكونات والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام. لكل 100 ملليغرام من العينة، إضافة ملليلتر واحد من العازلة تحلل. مع نفس الماصة المستخدمة لإضافة العازلة تحلل، ماصة بعناية lysate الناتجة صعودا وهبوطا لتفتيت الخلايا ومزيج.
مواصلة الأنابيب عموما ل25 إلى 30 السكتات الدماغية حتى العينة لم يعد لزجة. تعيين العينات على الجليد لمدة 10 دقائق إلى lyse. ثم تدور العينات في جهاز طرد مركزي قبل التبريد في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق في 10،000 مرات ز.
كبيرة فضفاضة بيليه غائم أشكال في الجزء السفلي من الأنبوب. الحرص على عدم إزعاج بيليه، وجمع lysate في أنبوب جديد وتسجيل حجم لكل عينة. لمنع تحلل العينات، تأكد من أن العينات تظل باردة طوال البروتوكول المتبقي الذي يخزن على الجليد أو عند أربع درجات مئوية كلما أمكن ذلك.
الآن، حساب الحجم المطلوب من الخرز المغناطيسي إلى جانب البروتين المضادة المناسبة ملزمة، البروتين G.for واحد ملليلتر من lysate، واستخدام 375 ميكرولترات من الخرز البروتين G للوصول إلى 30 ملليغرام لكل ملليلتر. ضع محلول الخرز في أنبوب 1.7 ملليلتر على رف أنبوب مغناطيسي. إزالة المذيبات حبة وإضافة حجم متساو من عازلة التحلل الطازجة إلى الخرز.
على جهاز دوران أنبوب مقعد تعيين إلى 20 دورة في الدقيقة في أربع درجات مئوية، تدوير الأنبوب خمس دقائق لغسل. ضع الأنبوب على رف الأنبوب المغناطيسي وأزل مخزن الغسيل. بعد تكرار غسل مرتين أكثر، إضافة العازلة تحلل في وحدة التخزين الأصلي لتكبيل الخرز.
يُخزن عند أربع درجات مئوية أو على الجليد حتى الاستخدام. إضافة 50 ميكرولترات من الخرز التوازنية لكل ملليلتر واحد من lysate وتدوير في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم ضع الأنبوب على رف المغناطيس وجمع الليساتي في أنبوب جديد.
تجاهل الخرز المستخدمة. إلى lysate ، إضافة 25 ميكروليترات من الخرز توازن لكل ملليلتر واحد وتدوير في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. تخزين الخرز البروتين توازنها المتبقية في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في الصباح، ضع الأنبوب على رف المغناطيس وجمع الليساتي في أنبوب جديد. تجاهل الخرز المستخدمة. من lysate مسح، والاحتفاظ 50 ميكروليتر كتحكم الإدخال عينة.
تخزين في ناقص 80 درجة مئوية. لكل ملليلتر واحد من lysate مسح، إضافة خمسة ميكروغرام من الأجسام المضادة HA. لمنع فقدان العينة، ختم غطاء أنبوب مع فيلم المختبر وتدوير العينات 16 إلى 18 ساعة في أربع درجات مئوية.
لكل ملليلتر واحد من lysate مسح، إضافة 300 ميكرولترات من الخرز البروتين G. إعادة رأس غطاء أنبوب مع فيلم المختبر وتدوير لمدة ساعتين في أربع درجات مئوية. ضع أنبوب العينة على رف المغناطيس للسماح للخرزات بالاقطار عن الليسات IPed.
ماصة قبالة تدفق من خلال lysate وتجاهل، والاحتفاظ بالخرز. إضافة 800 ميكرولترات من ارتفاع الملح غسل العازلة إلى الخرز. ضع الأنبوب على دوار لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
ضع أنبوب العينة على رف المغناطيس واسمح للخرزات بالاقطار عن الغسل. إزالة وتجاهل غسل. إضافة 800 ميكرولترات أخرى من ارتفاع الملح غسل العازلة إلى الخرز.
أغلق الأنبوب واسمح له بالتدوير لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ضع أنبوب العينة على رف المغناطيس واسمح للخرزات بالاقطار عن الغسل. إزالة وتجاهل غسل.
كرر الغسيل مرة أخرى. بعد الغسيل، إضافة 3.5 ميكرولترات من 14.2 المولى بيتا mercaptoethanol إلى الخرز ومزيج من دوامة لمدة 15 ثانية. استخراج RNA باستخدام طقم تنقية الحمض النووي الريبي التجاري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
Elute العينة في 30 ميكرولترات من المياه الحرة RNase. تخزين العينة في ناقص 80 درجة مئوية. في هذه الدراسة، تم عزل القليل جدا من الجيش الملكي النيبالي من العينات التي تفتقر إما Cre أو Rpl22HA مما يدل على فعالية هذا البروتوكول للحد من خلفية IP وعزل الحمض النووي الريبي الموسومة الأصلية HA.
تم اختبار سلسلة من الأجسام المضادة في بروتوكولات عزل الحمض النووي الريبي في عينات إيجابية من Cre و Rpl221HA. وتبين هذه النتائج أن اختيار الكاشف يمكن أن يكون له تأثير كبير على كفاءة الملكية الفكرية. تم فحص فعالية نظام ريبوتاج لعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوزومات.
وبالنسبة لكل من مدخلات النوع البري والأنماط الجينية IP، كان تركيز المدخلات أعلى بكثير من تركيز IP مما يشير إلى وجود المزيد من الحمض النووي الريبي في عينة الإدخال. في مجموع برك الحمض النووي الريبي، كان من المتوقع أن تكون قيم عدد RNA سلامة بالقرب من 10 مع ارتفاع RIN يرتبط إلى أعلى الاستدلال على سلامة العينة والجودة. وفي حين أن عينات الملكية الفكرية كانت أقل من المدخلات، فإن التانتان لا يزالان ضمن نطاق مقبول ولا يعتمدان على نموذج جيني للعينات.
وبصرف النظر عن تربية والحفاظ على الظروف الحرة RNase، يجب على الباحثين التأكد من جمع والحفاظ على كل عينة المقترحة. إن الإدخال RNA بشكل خاص هو المفتاح لأنواع متعددة من التحليلات المصب. بالنسبة لمختبرنا، نقوم بشكل عام بإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي بعد الاعتناد.
وهذا يسمح لنا بالاستعلام عن كامل قبة النص لجمعية الريبوسوم. وتشمل البدائل تحليل المنشآت الصغرى أو الـ RT-PCR الكمي. بالنسبة لنا، هذا النظام يسمح لنا لتحديد التغيرات في الريبوسوم المرتبطة RNAs مع طفرة من البروتينات RNA ملزمة محددة.
