وقد دعمت وزارة الصحة الإيطالية هذه الدراسة (أرسي 2013-بيو 15). نشكر باربرا ميشيلي لمساعدتها التقنية الممتازة.

في هذا البروتوكول، يتم جمع قلوب الإنسان خلال إكسبلانتاتيون متعدد الأجسام (وقت نقص التروية الباردة من 4-12 ساعة، يعني 6 ± 2 ح) من الجهات المانحة متعددة الأعضاء استبعادها من زرع الأعضاء لأسباب تقنية أو وظيفية، على الرغم من المعلمات مخطط صدى القلب العادي. يتم إرسالها إلى بنك الأنسجة القلبية الوعائية في ميلانو، مركز مونزينو كارديولوجيك (ميلان، إيطاليا) لمصارف الصمامات الأبهري والرئوي. لا تستخدم المنشورات الخلفية التاجية للأغراض السريرية، لذلك يتم جمعها خلال عزل الصمام الأبهري والرئوي بعد الحصول على موافقة مستنيرة من أقارب المانحين. يتم جمع الأنسجة لزرع والبحوث إلا بعد موافقة الوالدين. على ورقة الموافقة، فإنهم يأذنون (أو لا) استخدام الأنسجة القلبية للبحث فقط إذا لم يكن مناسبا للاستخدام السريري البشري ( أي الميكروبيولوجية والوظيفية، والمرضية المشاكل)، وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاق منمركز مونزينو كارديولوجيك. 1. إعداد الصمام التاجي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد صمام الصمام التاجي البشري في أقرب وقت ممكن بعد الجهاز إكسلانتاتيون (وقت نقص التروية الباردة من 4-12 ح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غرفة نظيفة، وإزالة القلب من حقيبة النقل التي تحتوي على البرد (4 درجات مئوية) حل ( أي محلول ملحي أو متوازنة وروكولينز المتوسطة أو ولاية ويسكونسن). وضعه في دلو ووضعه في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية (بيوهازارد تدفق الهواء العمودي، فئة A، تصنيف ممارسات التصنيع الجيدة (غمب) للمضي قدما في إعداد صمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القلب على ثنى المتاح العقيمة في مجلس الوزراء. باستخدام مشرط العقيمة القابل للتصرف، وقطع القلب تماما، عموديا على محورها الرئيسي، على مستوى البطينين الأيسر والأيمن، حوالي 4 سم بعيدا عن قمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشريان الأورطي الصاعد والشريان الرئوي لعرض السقف الأذيني الأيسر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملقط أوتوكلافابل معقمة ويختار، وقطع حول أوريكل الأيسر علىتركت الأذيني سقف، مما يجعل الصمام التاجي مرئية والسماح للنشرة التاجية كبيرة (الأمامي) ومنشور التاجي الصغيرة (الخلفي) التي سيتم تحديدها. ملاحظة: أنتيرو الجانبي والمسامير الإنسية الخلفي تحديد الحدود من النشرة الأمامية والمنطقة الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص قابل للتعقيم معقمة والملقط غير الصدمة، تشريح الأذين الأيسر وسماكة جدار البطين حول محيط صمام التاجي كله . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد استمرارية الصمام الشريان الأورطي. ملاحظة: البطين الأيسر يحتوي على صمام التاجي كله والحبال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل نشرة الصمام التاجي الأمامي من النشرة الخلفية الصمام التاجي، وقطع المنشور الخلفي على طول الإدراج مع البطين (الصوار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل النشرة الخلفية في محلول ملحي. قطع النشرة إلى قطع صغيرة (&lt;1 سم 2 ) ولفها بشكل فردي في رقائق الألومنيوم. المفاجئة تجميد لهم مع النيتروجين السائل. تنبيه: اتبع إجراءات السلامة التنظيمية عند استخدام النيتروجين السائل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير الجدول من مجلس الوزراء مع 70٪ محلول الأيزوبروبيل و 6٪ محلول بيروكسيد الهيدروجين في نهاية الإجراء. </li></ol></li></ol> 2. استخراج البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لالتقاط العينة المخزنة في النيتروجين السائل ووضعه على الفور على الجليد الجاف في حين لا تزال ملفوفة في رقائق الألومنيوم. لا تترك العينة إلى ذوبان الجليد أثناء أي نقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل طحن، والبرد الخزف / الزركونيوم هاون و بيستليس من نظام طاحونة (على سبيل المثال، كريوغريندر)، جنبا إلى جنب مع العينة، عن طريق وضعها في قارورة ديوار تحتوي على النيتروجين السائل (~ 500 مل). تنبيه: اتبع إجراءات السلامة التنظيمية عند استخدام النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع هاون والمدقة في مربع البوليسترين التي تحتوي على الثلج الجاف. إزالة العينة من رقائق الألومنيوم ووضعها في هاون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن روقال انه عينة مع مدقة كبيرة ضد هاون 15-20 مرات، وذلك باستخدام مفك لتدوير المدقة. مزج العينة مع طرف ملعقة قبل المبردة أثناء عملية الطحن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر مع المدقة الصغيرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينة الأرض إلى أنبوب وزنه سابقا (على سبيل المثال، 15 مل أنبوب الطرد المركزي) عن طريق قلب الأنبوب، ووضعه على هاون، وعكسها معا لنقل العينة إلى الأنبوب. استخدام ملعقة قبل المبردة لاستعادة جميع المواد من الهاون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الأنبوب مع العينة على الجليد الجاف لتجنب عينة ذوبان أثناء نقل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الوزن الصافي للعينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف الهاون والمدقات بعد كل عينة وتطهيرها عن طريق التعقيم أو تسخينها في 200 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينة المسحوق من أنبوب الطرد المركزي إلى أنبوب زجاجي من الخالط عن طريق انقلاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تصفية اليوريا بوف(8 M اليوريا، 2 M ثيوريا، 4٪ ث / V تشابس، 20 ملي تريس، و 55 ملي ديثيوتريتول) إلى أنبوب زجاجي، 200 ميكرولتر من اليوريا العازلة لكل 10 ملغ من الأنسجة المسحوقة. ملاحظة: المتبقية عينة مسحوق اليسار في أنبوب الطرد المركزي يمكن استردادها باستخدام جزء من حجم المحسوبة من اليوريا العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجانس العينة باستخدام النمام مجهزة هاون الزجاج البورسليكات و بيتيترافلوروثيلين (بتف) مدقة. اضغط ببطء المدقة على العينة مع حركة التواء (1500 دورة في الدقيقة) 10 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة طاف ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي 1.7 مل نظيفة. مرة أخرى استخراج العينة المتبقية مع العازلة اليوريا الطازجة، مضيفا نصف حجم المستخدمة خلال الاستخراج الأول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة طاف والجمع بينه وبين طاف من الخطوة 2.11. وضع طاف مجتمعة على مدورة أنبوب لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي أنبوب لمدة 30 دقيقة في 13،000 زغ و 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد طاف أد قياس تركيز البروتين باستخدام فحص البروتين برادفورد، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تخزين العينة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li></ol>

<ol>
	<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).</li><li>Hanash, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+proteomics.">Disease proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).</li><li>Ahram, M., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+Discovery+of+Disease+Biomarkers.">Proteomics Discovery of Disease Biomarkers.</a> Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).</li><li>Chandramouli, K., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+challenges,+techniques+and+possibilities+to+overcome+biological+sample+complexity.">Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity.</a> Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).</li><li>Singleton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+bioanalytical+sample+preparation+for+LC-MS+analysis.">Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis.</a> Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).</li><li>Williams, T. H., Jew, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+mitral+valve+passive+flap+theory+overstated?+An+active+valve+is+hypothesized.">Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized.</a> Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).</li><li>Rabkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+interstitial+myofibroblasts+express+catabolic+enzymes+and+mediate+matrix+remodeling+in+myxomatous+heart+valves.">Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves.</a> Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).</li><li>Martins Cde, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mitral+valve+proteomic+profiles+in+rheumatic+heart+disease+and+myxomatous+degeneration.">Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration.</a> Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).</li><li>Tan, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+proteome+of+degenerative+human+mitral+valves.">Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves.</a> Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).</li><li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+of+platelets+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Proteome of platelets in patients with coronary artery disease.</a> Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).</li><li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+human+low-density+lipoprotein+reveals+the+presence+of+prenylcysteine+lyase,+a+hydrogen+peroxide-generating+enzyme.">Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme.</a> Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+density+lipoprotein-mediated+signal+transduction+and+plasminogen+activator+inhibitor+type+1+in+cultured+HepG2+cells.">Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells.</a> Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).</li><li>Brioschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+human+mitral+valve+proteome:+A+preliminary+investigation+by+gel-based+and+gel-free+proteomic+approaches.">Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches.</a> Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).</li><li>Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+endothelial+cell+secretome:+a+means+of+studying+the+pleiotropic+effects+of+Hmg-CoA+reductase+inhibitors.">Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors.</a> J Proteomics. 78, 346-361 (2013).</li><li>Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+carbamylation+in+urea+solution+using+ammonium-containing+buffers.">Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers.</a> Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).</li><li>Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+solubilization+of+proteins+in+two-dimensional+electrophoresis+with+immobilized+pH+gradients.">Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).</li><li>Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+and+proteomics:+un+amour+impossible?.">Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?.</a> Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).</li><li>Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+analysis+of+histones.">Extraction, purification and analysis of histones.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).</li><li>Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment:+application+to+endoplasmic+reticulum.">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).</li><li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics.">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).</li><li>Mann, M., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+proteomics:+the+case+for+high+resolution+and+high+mass+accuracy.">Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).</li><li>Thakur, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+highly+sensitive+proteome+coverage+by+LC-MS/MS+without+prefractionation.">Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).</li><li>Loardi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+mitral+valve+prolapse:+the+harvest+is+big,+but+the+workers+are+few.">Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few.</a> Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).</li><li>Schoen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+concepts+of+cardiac+valve+dynamics:+the+continuum+of+development,+functional+structure,+pathobiology,+and+tissue+engineering.">Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering.</a> Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).</li><li>Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+anatomic+and+physiologic+overview+of+the+porcine+heart.">A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

خطوة واحدة حاسمة من هذا البروتوكول هو استخدام النيتروجين السائل لتجميد العينة والبرد نظام طاحونة. إن استخدام النيتروجين السائل يمنع التدهور البيولوجي ويسمح بالمسحوق الفعال، ولكنه يتطلب تدريبا خاصا للتعامل الآمن. في هذا البروت?...

وقد غيرت الأدلة الأخيرة فهم أدوار الآليات التنظيمية العديدة التي تحدث بعد التوليف مرنا. في الواقع، عمليات متعدية، ما بعد النسخي، وعمليات بروتين يمكن أن تنظم بروتين وفرة وظيفة. العقيدة - التي تقول أن تركيزات مرنا هي بروكسيات لتلك التي من البروتينات المقابلة، على افتراض أن مستويات النص هي المحدد الرئيسي للوفرة البروتين - وقد تم تنقيح جزئي. في المقام الأول، ومستويات النص تتنبأ جزئيا فقط وفرة البروتين، مما يشير إلى أن أحداث ما بعد النسخي تحدث لتنظيم البروتينات داخل الخلايا 1 ، 2 . وعلاوة على ذلك، والبروتينات تملي في نهاية المطاف وظيفة الخلية، وبالتالي تملي النمط الظاهري، والتي يمكن أن تخضع لتغييرات ديناميكية في الاستجابة لعقاقير أوتوكرين، باراكرين، والغدد الصماء. الوسطاء المنقولين بالدم؛ درجة الحرارة؛ العلاج من الإدمان؛ وتطور المرضمنة. وهكذا، فإن تحليل التعبير تركز على مستوى البروتين مفيد لتوصيف بروتيوم وكشف التغيرات الحرجة التي تحدث لها كجزء من المرضية المرض 3 . ولذلك، فإن الفرص التي توفرها البروتيوميات لتوضيح الظروف الصحية والمرضية هائلة، على الرغم من التحديات التكنولوجية القائمة. المجالات الواعدة بشكل خاص للبحوث التي يمكن أن تسهم بروتيوميكس: تحديد تغيير التعبير البروتين على أي مستوى ( أي خلايا كاملة أو الأنسجة، المقصورات تحت الخلوية، والسوائل البيولوجية). وتحديد والتحقق، والتحقق من المؤشرات الحيوية الرواية مفيدة لتشخيص وتشخيص المرض. ونأمل، وتحديد أهداف البروتين الجديدة التي يمكن استخدامها لأغراض علاجية، فضلا عن تقييم فعالية الدواء والسمية 4 . التقاط تعقيديمثل البروتيوم تحديا تكنولوجيا. أدوات البروتين الحالية توفر الفرصة لأداء تحليل واسع النطاق، عالية الإنتاجية لتحديد، الكمي، والتحقق من صحة مستويات البروتين المتغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إدخال تقنيات تجزئة وإثراء، وتهدف إلى تجنب التدخل الناجم عن البروتينات الأكثر وفرة، كما تحسنت تحديد البروتين من خلال تضمين البروتينات الأقل وفرة. وأخيرا، تم تكملة البروتيوميات من خلال تحليل التعديلات بعد متعدية، والتي تظهر تدريجيا كمغيرات هامة من وظيفة البروتين. ومع ذلك، فإن إعداد العينة واستعادة البروتين في العينات البيولوجية تحت التحليل لا تزال الخطوات المحددة في سير العمل البروتين وزيادة إمكانية وقوع المزالق المحتملة 5 . في الواقع، في معظم تقنيات البيولوجيا الجزيئية التي يجب أن تكون الأمثل، والخطوات الأولى هي الأنسجة هوموجينيزاتأيون وتحلل الخلية، وخصوصا خلال تحليل البروتينات وفرة منخفضة التي أساليب التضخيم لا وجود لها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطبيعة الكيميائية للبروتينات يمكن أن تؤثر على الانتعاش الخاصة بهم. على سبيل المثال، تحليل البروتينات مسعور للغاية صعبة للغاية، لأنها تتعجل بسهولة خلال التركيز إسويلكتريك، في حين البروتينات عبر غشاء تقريبا غير قابلة للذوبان (راجع في المرجع 5). وعلاوة على ذلك، فإن تقلب تكوين الأنسجة يخلق حاجزا كبيرا لتطوير طريقة استخراج عالمية. وأخيرا، لأن ما يقرب من جميع العينات السريرية هي من كمية محدودة، فمن الضروري لتمكين إعداد البروتين مع الانتعاش القصوى والتكاثر من الحد الأدنى من كميات عينة 6 . يصف هذا العمل بروتوكول الأمثل لاستخراج البروتين من صمام القلب التاجي البشري العادي، الذي يمثل عينة صعبة للغاية لتحليل البروتين. صمام التاجي العادي هو كومبهيكل ليكس الكذب بين الأذين الأيسر والبطين الأيسر للقلب ( الشكل 1 ). فإنه يلعب دورا هاما في السيطرة على تدفق الدم من الأذين إلى البطين، ومنع ارتجاعي وضمان المستوى المناسب من إمدادات الأكسجين إلى الجسم كله، وبالتالي الحفاظ على الناتج القلبي الكافي. ومع ذلك، فإنه غالبا ما يعتبر أن يكون &quot;غير نشط&quot; الأنسجة، مع الخلوية منخفضة وعدد قليل من المكونات، وذلك أساسا في المصفوفة خارج الخلية. وذلك لأنه، في الظروف العادية، الخلايا الخلوية صمام المقيمين (فيكس) تقديم النمط الظاهري هادئ مع انخفاض معدل البروتين الحيوي 7 . ومع ذلك، فقد ثبت أنه في حالة المرضية، وعدد من مراكز فيينا الدولية في زيادة الإسفنجية وتفعيل تخليق البروتين، جنبا إلى جنب مع غيرها من التغيرات الوظيفية والمظاهر الظاهرية 8 . ولذلك، فإنه ليس من المستغرب أن الحد الأدنى من البيانات المتاحة فيوتركز الأدب على تحليل الصمامات التاجية المرضية 9 ، 10 ، والتي قد زيادة عدد فيك المنشط قد يفسر العدد المرتفع نسبيا من البروتينات التي تم تحديدها. في الختام، فإن هذا البروتوكول قد تعمل على تطوير فهم الآليات المسببة للأمراض المسؤولة عن أمراض الصمام التاجي من خلال دراسة مكونات بروتين صمام التاجي. والواقع أن الفهم الأكبر للعمليات المرضية الكامنة يمكن أن يساعد على تحسين الإدارة السريرية لأمراض الصمامات التي تعتمد مؤشراتها الحالية للتدخل إلى حد كبير على اعتبارات الدورة الدموية.

<table><tbody><tr><td>Saline solution</td><td></td><td></td><td>0.9 % NaCl</td></tr><tr><td>Eurocollins A</td><td>SALF</td><td>30874046</td><td>Balanced organ&#039;s transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins</td></tr><tr><td>Eurocollins B</td><td>SALF</td><td>30874022</td><td>Balanced organ&#039;s transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins</td></tr><tr><td>Wisconsin</td><td>Bridge life</td><td>RM/N 4081</td><td>Balanced organ&#039;s transport medium</td></tr><tr><td>Biohazard vertical flow air</td><td>Burdinola</td><td></td><td>Class A GMP classification</td></tr><tr><td>Dewar Flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nalgene 4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cryogrinder system</td><td>OPS diagnostics</td><td>CG 08-01</td><td>Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver</td></tr><tr><td>Stainless steel forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel spatula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable sterile scalpel</td><td>Medisafe</td><td>MS-10</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel scissors</td><td></td><td></td><td>Autoclavable</td></tr><tr><td>Stainless steel picks</td><td></td><td></td><td>Autoclavable</td></tr><tr><td>Disposable sterile drap</td><td>Mon&amp;amp;Tex</td><td>3.307.08</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizing solution with isopropyl alcohol</td><td></td><td></td><td>70% isopropyl alcohol</td></tr><tr><td>Sterilizing solution with hydrogen peroxide</td><td></td><td></td><td>6% hydrogen peroxide</td></tr><tr><td>Micropipette, 1 mL, with tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td>VWR international</td><td>9278</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL centrifuge tubes</td><td>VWR international</td><td>PIER90410</td><td></td></tr><tr><td>Urea buffer</td><td></td><td></td><td>8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma aldrich</td><td>U6504-1KG</td><td>To be used for Urea buffer</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma aldrich</td><td>T8656</td><td>To be used for Urea buffer</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma aldrich</td><td>C3023-5GR</td><td>To be used for Urea buffer</td></tr><tr><td>Dithiotreitol</td><td>Sigma aldrich</td><td>D0632-5G</td><td>To be used for Urea buffer</td></tr><tr><td>Syringe 50 mL</td><td>PIC</td><td></td><td>To be used to filter Urea buffer</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>To be used to filter Urea buffer</td></tr><tr><td>PFTE Pestle, 2 mL</td><td>Kartell</td><td>6302</td><td>Part of Potter-Elvehjem homogenizer</td></tr><tr><td>Borosilicate glass mortar</td><td>Kartell</td><td>6102</td><td>Part of Potter-Elvehjem homogenizer</td></tr><tr><td>Stirrer</td><td>VELP scientifica</td><td>Stirrer DLH</td><td>To be used for homogenization by Potter-Elvehjem</td></tr><tr><td>Bradford Protein assay</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>Pbi International</td><td>F205</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene box</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td>For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g</td></tr><tr><td>Freezer -80&amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precision balance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td>For sterilization</td></tr><tr><td>Cryogenic gloves for liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Professional forced ventilation and natural air convection oven</td><td></td><td></td><td>For sterilization</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma aldrich</td><td>P8340-5ML</td><td>100X solution</td></tr><tr><td>ProteoExtract Protein Precipitation Kit</td><td>Calbiochem</td><td>539180</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>www.cytoscape.org</td><td>version 2.7</td><td>Software platform for Gene Ontology analysis</td></tr><tr><td>BiNGO</td><td>http://apps.cytoscape.org/apps/bingo</td><td>version 3.0.3</td><td>Plugin for Gene ontology analysis</td></tr><tr><td>AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-97494</td><td>Mouse monoclonal antibody against CryAB</td></tr><tr><td>Septin-11 Antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-83824</td><td>Rabbit polyclonal antibody against septin-11</td></tr><tr><td>FHL1 Antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP-188745</td><td>Rabbit polyclonal antibody against FHL-1</td></tr><tr><td>Dermatopontin Antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB110-68135</td><td>Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin</td></tr><tr><td>Goat Anti mouse IgG HRP</td><td>Sigma aldrich</td><td>A4416-0.5ML</td><td>Secondary antibody for immunoblotting</td></tr><tr><td>Goat Anti rabbit IgG HRP</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>170-5046</td><td>Secondary antibody for immunoblotting</td></tr></tbody></table>

optimized protocol for the extraction of proteins from the human mitral valve

تحليل بروتيوم الخلوية يمكن أن تساعد على توضيح الآليات الجزيئية الكامنة الأمراض بسبب تطوير التكنولوجيات التي تسمح على نطاق واسع تحديد وكمية من البروتينات الموجودة في النظم البيولوجية المعقدة.المعرفة المكتسبة من نهج البروتين يمكن أن تؤدي إلى فهم أفضل للآليات المسببة للأمراض الكامنة وراء الأمراض، والسماح لتحديد علامات التشخيص والتشخيص الرواية جديدة، ونأمل، من الأهداف العلاجية. ومع ذلك، فإن الصمام التاجي القلب يمثل عينة صعبة للغاية لتحليل البروتين بسبب انخفاض الخلوية في بروتيوغليكان والمصفوفة خارج الخلية المخصب الكولاجين. وهذا يجعل من الصعب استخراج البروتينات لتحليل البروتين العالمي. يصف هذا العمل بروتوكول متوافق مع تحليل البروتين لاحق، مثل البروتينات الكمية و إمونوبلوتينغ. وهذا يمكن أن يسمح للارتباط البيانات قلقز التعبير البروتين مع البيانات على التعبير الكمي مرنا وغير الكمي تحليل المناعية. في الواقع، هذه النهج، عندما يؤديها معا، سيؤدي إلى فهم أكثر شمولا للآليات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض، من مرنا إلى ما بعد متعدية تعديل البروتين. وهكذا، يمكن لهذه الطريقة تكون ذات صلة للباحثين المهتمين في دراسة أمراض القلب صمام فيسيوباثولوغي.

استخراج و حل البروتينات في العازلة اليوريا هو متوافق مباشرة مع الأساليب البروتينية على أساس إزلكتروفوكوسينغ (ثنائي الأبعاد الكهربائي (2-دي) 11 والتركيز السائل تركيز كهروضوئية (إيف) 12 ) مع إمونوبلوتينغ بعد التخفيف في العازلة ...

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve at JoVE.com

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

تكوين البروتين من صمام الصمام التاجي البشري لا يزال غير معروف جزئيا، لأن تحليله معقد من قبل الخلوية منخفضة، وبالتالي من خلال انخفاض البروتين الحيوي. هذا العمل يوفر بروتوكول لاستخراج البروتين بكفاءة لتحليل بروتيوم صمام الصمام التاجي.

بروتوكول محسن لاستخراج البروتينات من صمام ميترال الإنسان

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

optimized-protocol-for-extraction-proteins-from-human-mitral

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.8K Views.  Centro Cardiologico Monzino IRCCS.  تكوين البروتين من صمام الصمام التاجي البشري لا يزال غير معروف جزئيا، لأن تحليله معقد من قبل الخلوية منخفضة، وبالتالي من خلال انخفاض البروتين الحيوي. هذا العمل يوفر بروتوكول لاستخراج البروتين بكفاءة لتحليل بروتيوم صمام الصمام التاجي. 

Video: Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative phosphorylation complexes encoded by the mitochondrial genome. Since all proteins synthesized by human mitoribosomes are integral membrane proteins, human mitoribosomes are tethered to the mitochondrial inner membrane during translation. Compared to the cytosolic ribosome the mitoribosome has a sedimentation coefficient of 55S, half the rRNA content, no 5S rRNA and 36 additional proteins. Therefore, a higher protein-to-RNA ratio and an atypical structure make the human mitoribosome substantially distinct from its cytosolic counterpart.
Despite the central importance of the mitoribosome to life, no protocols were available to purify the intact complex from human cell lines. Traditionally, mitoribosomes were isolated from mitochondria-rich animal tissues that required kilograms of starting material. We reasoned that mitochondria in dividing HEK293-derived human cells grown in nutrient-rich expression medium would have an active mitochondrial translation, and, therefore, could be a suitable source of material for the structural and biochemical studies of the mitoribosome. To investigate its structure, we developed a protocol for large-scale purification of intact mitoribosomes from HEK cells. Herein, we introduce nitrogen cavitation method as a faster, less labor-intensive and more efficient alternative to traditional mechanical shear-based methods for cell lysis. This resulted in preparations of the mitoribosome that allowed for its structural determination to high resolution, revealing the composition of the intact human mitoribosome and its assembly intermediates. Here, we follow up on this work and present an optimized and more cost-effective method requiring only ~1010 cultured HEK cells. The method can be employed to purify human mitoribosomal translating complexes, mutants, quality control assemblies and mitoribosomal subunits intermediates. The purification can be linearly scaled up tenfold if needed, and also applied to other types of cells.

Mitochondria have specialized ribosomes that diverged from their bacterial and cytoplasmic counterparts. Here we show how mitoribosomes can be obtained from their native compartment in HEK cells. The method involves isolation of mitochondria from suspension cells and consequent purification of mitoribosomes.

عزل ميتوريبوسومي من الخلايا HEK السريع

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

دينامية البروتين وميرنا "تحليل بوليسوميس" من "قلب الفأرة متفرقة بعد نضح لانجيندورف"

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

الهجين واضح/الأزرق الكهربائي الأصلي للفصل وتحليل المجمعات التنفسية الميتوكوندريا السلسلة الفائقة

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, mitochondria exist in a series of complex morphologies, ranging from small oval organelles to a broad, reticulum-like network. Understanding how the mitochondrial reticulum expands and develops in response to diverse stimuli such as alterations in energy demand has long been a topic of research. A key aspect of this growth, or biogenesis, is the import of precursor proteins, originally encoded by the nuclear genome, synthesized in the cytosol, and translocated into various mitochondrial sub-compartments. Mitochondria have developed a sophisticated mechanism for this import process, involving many selective inner and outer membrane channels, known as the protein import machinery (PIM). Import into the mitochondrion is dependent on viable membrane potential and the availability of organelle-derived ATP through oxidative phosphorylation. Therefore its measurement can serve as a measure of organelle health. The PIM also exhibits a high level of adaptive plasticity in skeletal muscle that is tightly coupled to the energy status of the cell. For example, exercise training has been shown to increase import capacity, while muscle disuse reduces it, coincident with changes in markers of mitochondrial content. Although protein import is a critical step in the biogenesis and expansion of mitochondria, the process is not widely studied in skeletal muscle. Thus, this paper outlines how to use isolated and fully functional mitochondria from skeletal muscle to measure protein import capacity in order to promote a greater understanding of the methods involved and an appreciation of the importance of the pathway for organelle turnover in exercise, health, and disease.

Mitochondria are key metabolic organelles that exhibit a high level of phenotypic plasticity in skeletal muscle. The import of proteins from the cytosol is a critical pathway for organelle biogenesis, essential for the expansion of the reticulum and the maintenance of mitochondrial function. Therefore, protein import serves as a barometer of cellular health.

قياس قدرة استيراد البروتين للميتوكوندريا العضلية الهيكلية

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

<meta charset="utf8"></head><body>عزل الميتوكوندريا عن القوارض لدراسات الطاقة الحيوية عالية الجودة

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry to study metabolic impairments and disease. Consistent mitochondrial quality is necessary to properly investigate mitochondrial physiology and bioenergetics; however, many different published isolation methods are available for researchers. Although different experimental strategies require different isolation methods, the basic principles and procedures are similar. This protocol details a method capable of extracting well-coupled mitochondria from a variety of tissue sources, including small animals and cells. The steps outlined include organ dissection, mitochondrial purification, protein quantification, and various quality control checks. The primary quality control metric used to identify high-quality mitochondria is the respiratory control ratio (RCR). The RCR is the ratio of the respiratory rate during oxidative phosphorylation to the rate in the absence of ADP. Alternative metrics are discussed. While high RCR values relative to their tissue source are obtained using this protocol, several steps can be optimized to suit the individual needs of researchers. This procedure is robust and has consistently resulted in isolated mitochondria with above-average RCR values across animal models and tissue sources.

<meta charset="utf8"></head><body>أضواء الكاتب: الكشف عن دور فوسفات الكالسيوم في الميتوكوندريا في قصور القلب والطاقة الحيوية

Bioenergetic and metabolomic studies on mitochondria have revealed their multifaceted role in many diseases, but the isolation methods for these organelles vary. The method detailed here is capable of purifying high-quality mitochondria from multiple tissue sources. Quality is determined by respiratory control ratios and other metrics assessed with high-resolution respirometry.

عزل قوي للميتوكوندريا عن أنسجة قلب القوارض 

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس<sup&gt; 15</sup&gt; N صفها الأيض، مناعي، الكمي والتحوير الطيف الكتلي الانجذاب

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Biology

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

عزل بروتين من الفأر الجنينية القلب صمام منطقة نامية

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

بروتوكول محسن لاستخراج البروتينات من صمام ميترال الإنسان

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

عزل ميتوريبوسومي من الخلايا HEK السريع

دينامية البروتين وميرنا "تحليل بوليسوميس" من "قلب الفأرة متفرقة بعد نضح لانجيندورف"

الهجين واضح/الأزرق الكهربائي الأصلي للفصل وتحليل المجمعات التنفسية الميتوكوندريا السلسلة الفائقة

قياس قدرة استيراد البروتين للميتوكوندريا العضلية الهيكلية

عزل قوي للميتوكوندريا عن أنسجة قلب القوارض

عزل قوي للميتوكوندريا عن أنسجة قلب القوارض

عزل قوي للميتوكوندريا عن أنسجة قلب القوارض

بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس

عزل بروتين من الفأر الجنينية القلب صمام منطقة نامية