משרד הבריאות האיטלקי תמך במחקר זה (RC 2013-BIO 15). אנו מודים לברברה מישלי על עזרתה הטכנית המצוינת.

בפרוטוקול זה, לבבות האדם נאספים במהלך explantation multiorgan (זמן איסכמיה קר של 4-12 שעות, כלומר 6 ± 2 שעות) מתורמים רב איברים שלא נכללו בהשתלת איברים מסיבות טכניות או פונקציונליות, למרות פרמטרים אקו-קרדיוגרפיים רגילים. הם נשלחים לבנק רקמות לב וכלי דם של מילאנו, מונזינו Cardiologic מרכז (מילאנו, איטליה) עבור הבנקאות של שסתומים אבי העורקים ריאתי. העלונים האחוריים המיטרליים אינם משמשים למטרות קליניות, ולכן הם נאספים במהלך בידוד שסתום אבי העורקים וריאתי לאחר קבלת הסכמה מדעת מצד קרובי התורמים. רקמת ההשתלה והמחקר נאספת רק לאחר הסכמת ההורים; בגיליון ההסכמה, הם מסמיכים (או לא) את השימוש ברקמת הלב למחקר רק אם אינו מתאים לשימוש קליני בבני אדם ( כלומר, בעיות מיקרוביולוגיות, תפקודיות וסרולוגיות), בהתאם להנחיות ועדת האתיקה שלמרכז קרדיולוגי של מונזינו. 1. הכנת שסתום Mitral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר שסתום מיטרלי האדם בהקדם האפשרי לאחר explantation איבר (זמן איסכמיה קרה של 4-12 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר נקי, הוצא את הלב מתיק ההובלה המכיל פתרון קר (4 מעלות צלזיוס) ( כלומר תמיסת מלח או אירוקולינים בינוניים או ויסקונסין). הכנס אותו לתוך דלי והכניס אותו ארון biosafety (זרימת אוויר אנכי ביוגזאר, Class A, Good Practices טוב (GMP) סיווג) להמשיך בהכנה שסתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הלב על עטיפה סטרילית חד פעמי בארון. בעזרת אזמל חד פעמי סטרילי, לחתוך את הלב לחלוטין, באופן אופקי לציר המרכזי שלה, על רמת החדרים השמאלית והימנית, כ 4 ס&quot;מ מן השיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את אבי העורקים עולה ועורק הריאה כדי להציג את הגג הפרוזדורי השמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים autoclavable סטרילית ומבחר, לחתוך סביב האוזן השמאלית עלהגג פרוזדורי שמאל, מה שהופך את שסתום המיטרלית גלוי ומאפשר עבור עלון גדול metral (הקדמי) ואת העלון קטן metral (אחורי) להיות מזוהה. הערה: אנטרו-לרוחב ופרוסקופים המדיאלי האחורי מגדירים את הגבול של העלון הקדמי והאזור האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מספריים autoclable סטרילי מלקחיים שאינם טראומטיים, לנתח את אטריום שמאל ועובי דופן החדר סביב היקף שסתום המיטרלית כולה . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי המשכיות שסתום מיטרו-אבי העורקים. הערה: החדר השמאלי מכיל את כל שסתום המיטרל והאקורדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את העלון הקדמי של שסתום המיטרל מעלון שסתום המטרל האחורי, חותך את העלון האחורי לאורך ההכנסה עם החדר (הקומיסר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העלון האחורי של תמיסת מלח. חותכים את עלון לחתיכות קטנות (&lt;1 ס&quot;מ 2 ) ו בנפרד לעטוף אותם בנייר אלומיניום. הצמד להקפיא אותם עם חנקן נוזלי. זהירות: בצע את נוהלי הבטיחות הארגוניים בעת השימוש בחנקן נוזלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את השולחן של הממשלה עם פתרון אלכוהול 70% איזופרופיל ו 6% מי חמצן פתרון בסוף ההליך. </li></ol></li></ol> 2. חלבון מיצוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים כדי לאסוף את המדגם מאוחסן חנקן נוזלי ומיד למקם אותו על קרח יבש בעוד עטוף בנייר אלומיניום. אל תשאיר את המדגם להפשר במהלך העברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שחיקה, צמרמורת חרסינה / זירקוניום ו העליונות של מערכת מלתעה ( למשל, CryoGrinder), יחד עם המדגם, על ידי לשים אותם בקבוק דיואר המכיל חנקן נוזלי (~ 500 מ&quot;ל). זהירות: בצע את נוהלי הבטיחות הארגוניים בעת השימוש בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את המרגמה ואת העלי בתיבה קלקר המכיל קרח יבש. הסר את המדגם מתוך רדיד אלומיניום והכניס אותו לתוך המלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Grind tהוא מדגם עם העלי הגדול נגד המרגמה 15-20 פעמים, באמצעות מברג לסובב את העלי. מערבבים את המדגם עם קצה של מרית טרום צונן במהלך תהליך השחזה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עם העלי הקטן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם הקרקע צינור שקלול בעבר ( למשל, צינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל) על ידי הפיכת הצינור, הצבתה על המלט, והפך אותם יחד כדי להעביר את המדגם לצינור. השתמש מרית מראש צונן לשחזר את כל החומר מן המרגמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינור עם המדגם על קרח יבש, כדי למנוע מדגם הפשרה במהלך ההעברה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב משקל נטו של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המלט ואת העלי אחרי כל מדגם ולטהר אותם על ידי מעוקר או חימום אותם ב 200 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם אבקת מן צינור צנטריפוגה כדי צינור זכוכית של homogenizer על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף Buree אוריאה מסונניםR (8 M אוריאה, 2 M thiourea, 4% w / v CHAPS, 20 מ&quot;מ טריס, ו dithiotreitol 55 מ&quot;מ) כדי צינור זכוכית, 200 μL של חיץ אוריאה עבור כל 10 מ&quot;ג אבקת רקמה. הערה: שאריות אבקת שיורית שנותר צינור צנטריפוגה ניתן לשחזר באמצעות חלק נפח מחושב של חיץ אוריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize המדגם באמצעות stirrer מצויד עם מרגמה זכוכית borosilicate ו עליון polytetrafluoroethylene (PTFE). לאט לאט לחץ על העלי על המדגם עם תנועה מתפתל (1,500 סל&quot;ד) 10 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את supernatant ולהעביר אותו צינור נקי 1.7 מ&quot;ל צנטריפוגות. שוב לחלץ את המדגם הנותר עם טריים אוריאה חיץ, הוספת חצי נפח בשימוש במהלך החילוץ הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את supernatant ולשלב אותו עם supernatant משלב 2.11. מניחים את supernatant משולב על מסובבת צינור במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור למשך 30 דקות ב XG 13,000 ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את supernatant אד למדוד את ריכוז החלבון באמצעות assay חלבון Bradford, לפי הוראות היצרן. חנות המדגם ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li></ol>

<ol>
	<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).</li><li>Hanash, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+proteomics.">Disease proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).</li><li>Ahram, M., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+Discovery+of+Disease+Biomarkers.">Proteomics Discovery of Disease Biomarkers.</a> Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).</li><li>Chandramouli, K., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+challenges,+techniques+and+possibilities+to+overcome+biological+sample+complexity.">Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity.</a> Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).</li><li>Singleton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+bioanalytical+sample+preparation+for+LC-MS+analysis.">Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis.</a> Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).</li><li>Williams, T. H., Jew, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+mitral+valve+passive+flap+theory+overstated?+An+active+valve+is+hypothesized.">Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized.</a> Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).</li><li>Rabkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+interstitial+myofibroblasts+express+catabolic+enzymes+and+mediate+matrix+remodeling+in+myxomatous+heart+valves.">Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves.</a> Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).</li><li>Martins Cde, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mitral+valve+proteomic+profiles+in+rheumatic+heart+disease+and+myxomatous+degeneration.">Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration.</a> Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).</li><li>Tan, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+proteome+of+degenerative+human+mitral+valves.">Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves.</a> Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).</li><li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+of+platelets+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Proteome of platelets in patients with coronary artery disease.</a> Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).</li><li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+human+low-density+lipoprotein+reveals+the+presence+of+prenylcysteine+lyase,+a+hydrogen+peroxide-generating+enzyme.">Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme.</a> Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+density+lipoprotein-mediated+signal+transduction+and+plasminogen+activator+inhibitor+type+1+in+cultured+HepG2+cells.">Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells.</a> Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).</li><li>Brioschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+human+mitral+valve+proteome:+A+preliminary+investigation+by+gel-based+and+gel-free+proteomic+approaches.">Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches.</a> Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).</li><li>Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+endothelial+cell+secretome:+a+means+of+studying+the+pleiotropic+effects+of+Hmg-CoA+reductase+inhibitors.">Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors.</a> J Proteomics. 78, 346-361 (2013).</li><li>Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+carbamylation+in+urea+solution+using+ammonium-containing+buffers.">Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers.</a> Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).</li><li>Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+solubilization+of+proteins+in+two-dimensional+electrophoresis+with+immobilized+pH+gradients.">Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).</li><li>Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+and+proteomics:+un+amour+impossible?.">Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?.</a> Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).</li><li>Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+analysis+of+histones.">Extraction, purification and analysis of histones.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).</li><li>Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment:+application+to+endoplasmic+reticulum.">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).</li><li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics.">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).</li><li>Mann, M., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+proteomics:+the+case+for+high+resolution+and+high+mass+accuracy.">Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).</li><li>Thakur, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+highly+sensitive+proteome+coverage+by+LC-MS/MS+without+prefractionation.">Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).</li><li>Loardi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+mitral+valve+prolapse:+the+harvest+is+big,+but+the+workers+are+few.">Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few.</a> Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).</li><li>Schoen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+concepts+of+cardiac+valve+dynamics:+the+continuum+of+development,+functional+structure,+pathobiology,+and+tissue+engineering.">Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering.</a> Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).</li><li>Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+anatomic+and+physiologic+overview+of+the+porcine+heart.">A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

צעד קריטי אחד של פרוטוקול זה הוא השימוש של חנקן נוזלי להקפיא את המדגם כדי לצנן את מערכת המטחנה. השימוש בחנקן נוזלי מונע השפלה ביולוגית ומאפשר אבקה יעילה, אבל זה דורש הכשרה ספציפית לטיפול בטוח. בפרוטוקול זה תכונות מערכת המטחנה עבו?...

עדויות האחרונות שינו את ההבנה של התפקידים של מנגנונים רגולטוריים רבים המתרחשים לאחר סינתזת mRNA. ואכן, תהליכים טרנסלציוניים, פוסט-תעתיקיים ופרוטוליטיים יכולים להסדיר את שפע החלבון ולתפקודו. הדוגמה - שאומרת כי ריכוזי ה- mRNA הם פרוקסי לאלה של החלבונים המתאימים, בהנחה שרמות התמלילים הן הגורם העיקרי לשפע החלבון - תוקנו חלקית. למרות זאת, רמות התמליל רק מנבאות באופן חלקי את כמות החלבון, מה שמרמז על אירועים פוסט-תעתיק להתרחש כדי לווסת את החלבונים בתוך תאים 1 , 2 . יתר על כן, חלבונים בסופו של דבר להכתיב את הפונקציה של התא ולכן להכתיב פנוטיפ שלה, אשר יכול לעבור שינויים דינמיים בתגובה גורמים אוטוקרינית, פאראקרין, אנדוקרינית; מתווכים עם דם; טֶמפֶּרָטוּרָה; טיפול תרופתי; ואת המחלה לפתחמנט. לפיכך, ניתוח הביטוי התמקדו ברמת החלבון הוא שימושי כדי לאפיין את proteome ולפרם את השינויים הקריטיים המתרחשים אליו כחלק מחולי המחלה 3 . לכן, את ההזדמנויות כי proteomics הנוכחי כדי להבהיר בריאות ומחלות התנאים הם אדירים, למרות האתגרים הטכנולוגיים הקיימים. התחומים המבטיחים במיוחד של מחקר, שבהם יכולים פרוטאומיסטים לתרום: זיהוי של ביטוי חלבון שונה בכל רמה ( כלומר, תאים שלמים או רקמות, תאים תת-תאיים ונוזלים ביולוגיים); זיהוי, אימות ואימות של סמנים ביולוגיים חדשים המשמשים לאבחון ולפרוגנוזה של מחלות; וכן, בתקווה, זיהוי של מטרות חלבון חדש שניתן להשתמש בהם למטרות טיפוליות, כמו גם להערכת יעילות התרופות ואת הרעילות 4 . לכידת המורכבות שלהפרוטאום מייצג אתגר טכנולוגי. כלים proteomic הנוכחי מציעים את ההזדמנות לבצע בקנה מידה גדול, תפוקה גבוהה ניתוח עבור זיהוי, כימות, ואימות של רמות חלבון השתנה. בנוסף, הכנסת שיטות חלוקה והעשרה, שמטרתן למנוע את ההפרעה הנגרמת על ידי החלבונים השופעים ביותר, שיפרה גם את זיהוי החלבון על ידי הכללת החלבונים הפחות שופעים. לבסוף, proteomics הושלמה על ידי ניתוח של שינויים לאחר translational, אשר בהדרגה מופיעים כמו מאפננים חשובים של תפקוד החלבון. עם זאת, ההכנה המדגם התאוששות חלבון בדגימות ביולוגי תחת ניתוח עדיין להישאר הגבלת הצעדים של זרימת העבודה proteomic ולהגדיל את הפוטנציאל האפשרי pitfalls 5 . ואכן, ברוב טכניקות ביולוגיה מולקולרית כי חייב להיות מותאם, הצעדים הראשונים הם homogenizat רקמותיון ותאי תא, במיוחד במהלך ניתוח של חלבונים בשפע נמוכה עבורם שיטות הגברה לא קיימים. בנוסף, הטבע הכימי של חלבונים יכול להשפיע על ההתאוששות שלהם. לדוגמה, ניתוח של חלבונים הידרופובי מאוד הוא מאתגר מאוד, כי הם מזרזים בקלות במהלך ההתמקדות isoelectric, בעוד חלבונים ממברנה טרנס הם כמעט בלתי מסיסים (נסקרת ב הפניה 5). יתר על כן, השתנות הרכב הרקמה יוצרת מחסום משמעותי לפיתוח שיטת החילוץ האוניברסלית. לבסוף, כי כמעט כל הדגימות הקליניות הן של כמות מוגבלת, זה חיוני כדי לאפשר הכנת חלבון עם התאוששות מקסימלית reproducibility מ כמויות מדגם מינימלי 6 . עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול אופטימיזציה עבור החילוץ חלבון מן השסתום המיטרלי של הלב האנושי, המייצג מדגם מאתגר מאוד עבור ניתוח proteomic. שסתום מיטרלי רגיל הוא compמבנה lx שוכב בין אטריום שמאל החדר השמאלי של הלב ( איור 1 ). זה משחק תפקיד חשוב בשליטה על זרימת הדם מן אטריום החדר, מניעת backflow ולהבטיח את רמת נאותה של אספקת חמצן לכל הגוף, ובכך לשמור על פלט לב נאותה. עם זאת, הוא נחשב לעתים קרובות רקמה &quot;לא פעילה&quot;, עם תאיות נמוכה כמה רכיבים, בעיקר מטריקס תאיים. הסיבה לכך היא, בתנאים נורמליים, התאים intervitial valvular תושב (VICs) להציג פנוטיפ שקט עם שיעור נמוך biosynthesis חלבון 7 . עם זאת, הוכח כי במצב פתולוגי, מספר VICs ב spongiosa עולה סינתזת החלבון שלהם מופעל, יחד עם שינויים פונקציונליים אחרים פנוטיפי 8 . לכן, אין זה מפתיע כי הנתונים המינימליים הזמיניםהספרות מתמקדת בניתוח של שסתומים מיטרליים פתולוגיים 9 , 10 , שבהם מספר מוגבר של VICs מופעל עשוי להסביר את המספר הגבוה יחסית של חלבונים מזוהים. לסיכום, פרוטוקול זה עשוי לשמש כדי להבין את ההבנה של מנגנונים פתוגניים האחראים על מחלות שסתום מיטרלי באמצעות מחקר של מרכיבי חלבון מיטרלי שסתום. ואכן, הבנה גדולה יותר של התהליכים הפתולוגיים הבסיסיים יכולה לסייע בשיפור הניהול הקליני של מחלות שסתום, אשר האינדיקציות הנוכחיות שלהם להתערבות מבוססות במידה רבה על שיקולים המודינאמיים.

<table><tbody><tr><td>Saline solution</td><td></td><td></td><td>0.9 % NaCl</td></tr><tr><td>Eurocollins A</td><td>SALF</td><td>30874046</td><td>Balanced organ&#039;s transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins</td></tr><tr><td>Eurocollins B</td><td>SALF</td><td>30874022</td><td>Balanced organ&#039;s transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins</td></tr><tr><td>Wisconsin</td><td>Bridge life</td><td>RM/N 4081</td><td>Balanced organ&#039;s transport medium</td></tr><tr><td>Biohazard vertical flow air</td><td>Burdinola</td><td></td><td>Class A GMP classification</td></tr><tr><td>Dewar Flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nalgene 4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cryogrinder system</td><td>OPS diagnostics</td><td>CG 08-01</td><td>Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver</td></tr><tr><td>Stainless steel forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel spatula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable sterile scalpel</td><td>Medisafe</td><td>MS-10</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel scissors</td><td></td><td></td><td>Autoclavable</td></tr><tr><td>Stainless steel picks</td><td></td><td></td><td>Autoclavable</td></tr><tr><td>Disposable sterile drap</td><td>Mon&amp;amp;Tex</td><td>3.307.08</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizing solution with isopropyl alcohol</td><td></td><td></td><td>70% isopropyl alcohol</td></tr><tr><td>Sterilizing solution with hydrogen peroxide</td><td></td><td></td><td>6% hydrogen peroxide</td></tr><tr><td>Micropipette, 1 mL, with tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td>VWR international</td><td>9278</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL centrifuge tubes</td><td>VWR international</td><td>PIER90410</td><td></td></tr><tr><td>Urea buffer</td><td></td><td></td><td>8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma aldrich</td><td>U6504-1KG</td><td>To be used for Urea buffer</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma aldrich</td><td>T8656</td><td>To be used for Urea buffer</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma aldrich</td><td>C3023-5GR</td><td>To be used for Urea buffer</td></tr><tr><td>Dithiotreitol</td><td>Sigma aldrich</td><td>D0632-5G</td><td>To be used for Urea buffer</td></tr><tr><td>Syringe 50 mL</td><td>PIC</td><td></td><td>To be used to filter Urea buffer</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>To be used to filter Urea buffer</td></tr><tr><td>PFTE Pestle, 2 mL</td><td>Kartell</td><td>6302</td><td>Part of Potter-Elvehjem homogenizer</td></tr><tr><td>Borosilicate glass mortar</td><td>Kartell</td><td>6102</td><td>Part of Potter-Elvehjem homogenizer</td></tr><tr><td>Stirrer</td><td>VELP scientifica</td><td>Stirrer DLH</td><td>To be used for homogenization by Potter-Elvehjem</td></tr><tr><td>Bradford Protein assay</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>Pbi International</td><td>F205</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene box</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td>For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g</td></tr><tr><td>Freezer -80&amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precision balance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td>For sterilization</td></tr><tr><td>Cryogenic gloves for liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Professional forced ventilation and natural air convection oven</td><td></td><td></td><td>For sterilization</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma aldrich</td><td>P8340-5ML</td><td>100X solution</td></tr><tr><td>ProteoExtract Protein Precipitation Kit</td><td>Calbiochem</td><td>539180</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>www.cytoscape.org</td><td>version 2.7</td><td>Software platform for Gene Ontology analysis</td></tr><tr><td>BiNGO</td><td>http://apps.cytoscape.org/apps/bingo</td><td>version 3.0.3</td><td>Plugin for Gene ontology analysis</td></tr><tr><td>AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-97494</td><td>Mouse monoclonal antibody against CryAB</td></tr><tr><td>Septin-11 Antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-83824</td><td>Rabbit polyclonal antibody against septin-11</td></tr><tr><td>FHL1 Antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP-188745</td><td>Rabbit polyclonal antibody against FHL-1</td></tr><tr><td>Dermatopontin Antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB110-68135</td><td>Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin</td></tr><tr><td>Goat Anti mouse IgG HRP</td><td>Sigma aldrich</td><td>A4416-0.5ML</td><td>Secondary antibody for immunoblotting</td></tr><tr><td>Goat Anti rabbit IgG HRP</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>170-5046</td><td>Secondary antibody for immunoblotting</td></tr></tbody></table>

optimized protocol for the extraction of proteins from the human mitral valve

ניתוח של proteome הסלולר יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות עקב פיתוח של טכנולוגיות המאפשרים זיהוי בקנה מידה גדול וכימות של חלבונים הנוכחי במערכות ביולוגיות מורכבות.ידע שנרכש מתוך גישה proteomic יכול להוביל הבנה טובה יותר של המנגנונים הפתוגניים המונחים ביסוד מחלות, ומאפשרת זיהוי של סמני מחלה אבחנתיים ופרוגנוסטיים חדשים, וכן, בתקווה, של מטרות טיפוליות. עם זאת, שסתום מיטרלי הלב מייצג מדגם מאתגר מאוד עבור ניתוח proteomic בגלל הסלולר נמוכה ב proteoglycan ו קולגן מועשר תאיים מטריקס. זה עושה את זה מאתגר לחלץ חלבונים לניתוח proteomic העולמי. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול התואם ניתוח חלבון לאחר מכן, כגון proteomics כמותי immunoblotting. זה יכול לאפשר את המתאם של נתונים דאגהG ביטוי חלבון עם נתונים על ביטוי mRNA כמותי ניתוח כמותי אימונוהיסטוכימיים. ואכן, גישות אלה, כאשר ביצע יחד, יוביל להבנה מקיפה יותר של המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות, מ mRNA כדי שינוי שלאחר החלבון translational. לכן, שיטה זו יכולה להיות רלוונטית לחוקרים המעוניינים במחקר physiopathology שסתום הלב.

החילוץ והפירוק של חלבונים במאגר אוריאה תואם באופן ישיר עם שיטות proteomic מבוסס על isoelectrofocusing (דו מימדי אלקטרופורזה (2-DE) 11 ו בשלב נוזלי isoelectric התמקדות (IEF) 12 ) ועם immunoblotting לאחר דילול במאגר Laemmli 13 המכיל קוקטייל מעכב פרוט...

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve at JoVE.com

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

הרכב החלבון של שסתום המיטרל האנושי עדיין לא ידוע חלקית, משום שהניתוח שלו מסובך על ידי תאימות נמוכה ולכן על ידי ביוסינתזה חלבונית נמוכה. עבודה זו מספקת פרוטוקול ביעילות לחלץ חלבון לניתוח של proteome שסתום מיטרלי.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

optimized-protocol-for-extraction-proteins-from-human-mitral

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.8K Views.  Centro Cardiologico Monzino IRCCS.  הרכב החלבון של שסתום המיטרל האנושי עדיין לא ידוע חלקית, משום שהניתוח שלו מסובך על ידי תאימות נמוכה ולכן על ידי ביוסינתזה חלבונית נמוכה. עבודה זו מספקת פרוטוקול ביעילות לחלץ חלבון לניתוח של proteome שסתום מיטרלי. 

Video: Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative phosphorylation complexes encoded by the mitochondrial genome. Since all proteins synthesized by human mitoribosomes are integral membrane proteins, human mitoribosomes are tethered to the mitochondrial inner membrane during translation. Compared to the cytosolic ribosome the mitoribosome has a sedimentation coefficient of 55S, half the rRNA content, no 5S rRNA and 36 additional proteins. Therefore, a higher protein-to-RNA ratio and an atypical structure make the human mitoribosome substantially distinct from its cytosolic counterpart.
Despite the central importance of the mitoribosome to life, no protocols were available to purify the intact complex from human cell lines. Traditionally, mitoribosomes were isolated from mitochondria-rich animal tissues that required kilograms of starting material. We reasoned that mitochondria in dividing HEK293-derived human cells grown in nutrient-rich expression medium would have an active mitochondrial translation, and, therefore, could be a suitable source of material for the structural and biochemical studies of the mitoribosome. To investigate its structure, we developed a protocol for large-scale purification of intact mitoribosomes from HEK cells. Herein, we introduce nitrogen cavitation method as a faster, less labor-intensive and more efficient alternative to traditional mechanical shear-based methods for cell lysis. This resulted in preparations of the mitoribosome that allowed for its structural determination to high resolution, revealing the composition of the intact human mitoribosome and its assembly intermediates. Here, we follow up on this work and present an optimized and more cost-effective method requiring only ~1010 cultured HEK cells. The method can be employed to purify human mitoribosomal translating complexes, mutants, quality control assemblies and mitoribosomal subunits intermediates. The purification can be linearly scaled up tenfold if needed, and also applied to other types of cells.

Mitochondria have specialized ribosomes that diverged from their bacterial and cytoplasmic counterparts. Here we show how mitoribosomes can be obtained from their native compartment in HEK cells. The method involves isolation of mitochondria from suspension cells and consequent purification of mitoribosomes.

בידוד מהיר של Mitoribosome מתאי HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

אלקטרופורזה היברידית ברורה/כחולה עבור הפרדה וניתוח של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלי מערכות-העל

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, mitochondria exist in a series of complex morphologies, ranging from small oval organelles to a broad, reticulum-like network. Understanding how the mitochondrial reticulum expands and develops in response to diverse stimuli such as alterations in energy demand has long been a topic of research. A key aspect of this growth, or biogenesis, is the import of precursor proteins, originally encoded by the nuclear genome, synthesized in the cytosol, and translocated into various mitochondrial sub-compartments. Mitochondria have developed a sophisticated mechanism for this import process, involving many selective inner and outer membrane channels, known as the protein import machinery (PIM). Import into the mitochondrion is dependent on viable membrane potential and the availability of organelle-derived ATP through oxidative phosphorylation. Therefore its measurement can serve as a measure of organelle health. The PIM also exhibits a high level of adaptive plasticity in skeletal muscle that is tightly coupled to the energy status of the cell. For example, exercise training has been shown to increase import capacity, while muscle disuse reduces it, coincident with changes in markers of mitochondrial content. Although protein import is a critical step in the biogenesis and expansion of mitochondria, the process is not widely studied in skeletal muscle. Thus, this paper outlines how to use isolated and fully functional mitochondria from skeletal muscle to measure protein import capacity in order to promote a greater understanding of the methods involved and an appreciation of the importance of the pathway for organelle turnover in exercise, health, and disease.

Mitochondria are key metabolic organelles that exhibit a high level of phenotypic plasticity in skeletal muscle. The import of proteins from the cytosol is a critical pathway for organelle biogenesis, essential for the expansion of the reticulum and the maintenance of mitochondrial function. Therefore, protein import serves as a barometer of cellular health.

מדידה של קיבולת ייבוא חלבון של המיטוכונדריה שריר השלד

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד מיטוכונדריאלי ממכרסמים למחקרים ביואנרגטיים איכותיים

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry to study metabolic impairments and disease. Consistent mitochondrial quality is necessary to properly investigate mitochondrial physiology and bioenergetics; however, many different published isolation methods are available for researchers. Although different experimental strategies require different isolation methods, the basic principles and procedures are similar. This protocol details a method capable of extracting well-coupled mitochondria from a variety of tissue sources, including small animals and cells. The steps outlined include organ dissection, mitochondrial purification, protein quantification, and various quality control checks. The primary quality control metric used to identify high-quality mitochondria is the respiratory control ratio (RCR). The RCR is the ratio of the respiratory rate during oxidative phosphorylation to the rate in the absence of ADP. Alternative metrics are discussed. While high RCR values relative to their tissue source are obtained using this protocol, several steps can be optimized to suit the individual needs of researchers. This procedure is robust and has consistently resulted in isolated mitochondria with above-average RCR values across animal models and tissue sources.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: חשיפת התפקיד של סידן פוספט מיטוכונדריאלי באי ספיקת לב ובביו-אנרגטיקה

Bioenergetic and metabolomic studies on mitochondria have revealed their multifaceted role in many diseases, but the isolation methods for these organelles vary. The method detailed here is capable of purifying high-quality mitochondria from multiple tissue sources. Quality is determined by respiratory control ratios and other metrics assessed with high-resolution respirometry.

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם 

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Biology

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

בידוד מהיר של Mitoribosome מתאי HEK

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

אלקטרופורזה היברידית ברורה/כחולה עבור הפרדה וניתוח של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלי מערכות-העל

מדידה של קיבולת ייבוא חלבון של המיטוכונדריה שריר השלד

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך

בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח