Il Ministero della Salute italiano ha sostenuto questo studio (RC 2013-BIO 15). Ringraziamo Barbara Micheli per la sua eccellente assistenza tecnica.

In questo protocollo, i cuori umani vengono raccolti durante l&#39;esplorazione multiorgano (tempi di ischemia fredda di 4-12 h, media 6 ± 2 h) dai donatori multi-organi esclusi dal trapianto di organi per motivi tecnici o funzionali, nonostante i normali parametri ecocardiografici. Sono inviati alla Banca Tissue Cardiovascolare di Milano, Centro Cardiologico Monzino (Milano, Italia) per l&#39;attività bancaria delle valvole aortiche e polmonari. I volantini posteriori mitraali non vengono utilizzati per scopi clinici, quindi vengono raccolti durante l&#39;isolamento delle valvole aortiche e delle valvole polmonari, dopo che il consenso informato è ottenuto dai parenti dei donatori. Il tessuto per il trapianto e la ricerca viene raccolto solo dopo il consenso dei genitori; Sul foglio di autorizzazione, autorizzano (o non) l&#39;uso del tessuto cardiaco per la ricerca solo se non è idoneo all&#39;uso clinico umano ( ad esempio, problemi microbiologici, funzionali e sierologici), seguendo le linee guida del comitato eticoCentro Cardiologico Monzino. 1. Preparazione della valvola mitrale <ol><li> Raccogliere la valvola mitrale umana il più presto possibile dopo l&#39;esplosione dell&#39;organo (tempo di ischemia fredda di 4-12 h). </li><li> In una stanza pulita, togliere il cuore dalla borsa di trasporto contenente una soluzione fredda (4 ° C) ( cioè soluzione salina o medie equilibrate Eurocollins o Wisconsin). Metterlo in un secchio e collocarlo in un armadio di biosicurezza (classificazione della classe A, Good Manufacturing Practices (GMP)) per procedere alla preparazione della valvola. </li><li> Posizionare il cuore su un drappo monouso sterile nell&#39;armadio. Usando un bisturi monouso sterile, tagliare completamente il cuore, perpendicolarmente al suo asse principale, sul livello dei ventricoli sinistro e destro, circa 4 cm di distanza dall&#39;apice. </li><li> Spostare l&#39;aorta ascendente e l&#39;arteria polmonare per visualizzare il tetto atriale sinistro. </li><li> Con pinze e scatti sterilizzabili sterilizzabili, tagliare attorno all&#39;orecchio sinistro sullaTetto atriale sinistro, rendendo visibile la valvola mitrale e consentendo di identificare il grande foglietto mitrale (anteriore) e il piccolo foglio mitrale (posteriore). NOTA: Gli antero laterali e le commissioni mediali posteriori definiscono il bordo del foglio anteriore e della zona posteriore. </li><li> Utilizzando forbici sterilizzabili autoclavabili e pinze non traumatiche, dissectare l&#39;atrio sinistro e lo spessore della parete del ventricolo attorno alla circonferenza di tutta la valvola mitrale . </li><li> Identificare la continuità della valvola mitro-aortica. NOTA: Il ventricolo sinistro contiene l&#39;intera valvola mitrale e gli accordi. </li><li> Separare il foglietto della valvola mitrale anteriore dal foglietto della valvola mitrale posteriore, tagliando il foglio posteriore lungo l&#39;inserimento con il ventricolo (commissure). </li><li> Lavare il foglietto posteriore nella soluzione salina. Tagliare il foglietto in piccoli pezzi (&lt;1 cm 2 ) e avvolgerli individualmente in fogli di alluminio. Snap-congelare con azoto liquido. Attenzione: Seguire le procedure di sicurezza organizzative quando si utilizza azoto liquido. <ol><li> Sanitizzare la tabella dell&#39;armadio con una soluzione alcolica al 70% di isopropilato e una soluzione al perossido di idrogeno al 6% alla fine della procedura. </li></ol></li></ol> 2. Estrazione della proteina <ol><li> Utilizzare pinze per prelevare il campione immagazzinato in azoto liquido e posizionarlo immediatamente in ghiaccio secco mentre ancora avvolto nel foglio di alluminio. Non lasciare scongelare il campione durante qualsiasi trasferimento. </li><li> Prima della macinazione, raffreddare il malta di porcellana / zirconio e pestelli di un sistema di macinazione ( ad esempio, CryoGrinder), insieme al campione, inserendoli in un pallone Dewar contenente azoto liquido (~ 500 mL). Attenzione: Seguire le procedure di sicurezza organizzative quando si utilizza azoto liquido. </li><li> Mettere il mortaio e il pestello in una scatola di polistirolo contenente ghiaccio secco. Rimuovere il campione dal foglio di alluminio e inserirlo nella malta. </li><li> Grind tCampione con il grande pestello contro la malta 15-20 volte, utilizzando il cacciavite per ruotare il pestello. Mescolare il campione con la punta di una spatola pre-raffreddata durante il processo di macinazione. <ol><li> Ripeti con il piccolo pestello. </li></ol></li><li> Trasferire il campione di massa a un tubo precedentemente pesato ( es. Tubo da centrifuga da 15 ml) invertendo il tubo, ponendolo sopra la malta e invertendo insieme per spostare il campione sul tubo. Utilizzare una spatola pre-raffreddata per recuperare tutto il materiale dalla malta. <ol><li> Tenere il tubo con il campione su ghiaccio secco per evitare il disgelo del campione durante il trasferimento. </li></ol></li><li> Calcolare il peso netto del campione. </li><li> Pulire la malta e il pestello dopo ogni campione e decontaminarli mediante autoclave o riscaldandoli a 200 ° C per 2 ore. </li><li> Trasferire il campione in polvere dal tubo di centrifuga al tubo di vetro di un omogeneizzatore per inversione. </li><li> Aggiungere bufere filtrato in ureaR (8 M urea, 2 M tiourea, 4% w / v CHAPS, 20 mM Tris e 55 mM dithiotreitolo) al tubo di vetro, 200 μl di buffer urea per ogni 10 mg di tessuto in polvere. NOTA: Il campione in polvere residuo lasciato nel tubo di centrifuga può essere recuperato usando una parte del volume calcolato di buffer urea. </li><li> Homogenizzare il campione utilizzando un agitatore dotato di un mulino di vetro borosilicato e un pestello di politetrafluoroetilene (PTFE). Premere lentamente il pestello sul campione con un movimento di torsione (1.500 giri / min) 10 volte. </li><li> Recuperare il surnatante e trasferirlo in un tubo centrifugo da 1,7 ml. Riprendere il campione rimanente con il buffer di urea fresco, aggiungendo metà del volume utilizzato durante la prima estrazione. </li><li> Ripetere il passaggio 2.10. </li><li> Recuperare il surnatante e combinarlo con il surnatante dal punto 2.11. Posizionare il supernatante combinato su un rotatore di tubo per 30 min. </li><li> Centrifugare il tubo per 30 minuti a 13.000 xg e 4 ° C. </li><li> Recuperare il surnatante anD misurare la concentrazione proteica utilizzando il saggio della proteina Bradford, secondo le istruzioni del produttore. Conservare il campione a -80 ° C fino all&#39;uso. </li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Un passo critico di questo protocollo è l&#39;uso di azoto liquido per congelare il campione e per raffreddare il sistema di macinazione. L&#39;utilizzo di azoto liquido evita il degrado biologico e consente una polverizzazione efficace, ma richiede una formazione specifica per una manipolazione sicura. In questo protocollo è previsto un sistema di macinazione per la macinazione del campione in quanto i piccoli campioni sono difficili da recuperare da mortai e pestelli standard. In questo ...

Recenti testimonianze hanno alterato la comprensione dei ruoli dei molti meccanismi regolatori che si verificano dopo la sintesi di mRNA. Infatti, i processi traslazionali, post-trascrizionali e proteolitici possono regolare l&#39;abbondanza e la funzione proteica. Il dogma, che afferma che le concentrazioni di mRNA sono proxy a quelle delle proteine ​​corrispondenti, assumendo che i livelli di trascritture sono il determinante principale dell&#39;abbondanza di proteine, è stata parzialmente riveduta. In effetti, i livelli di trascrizione solo parzialmente prevedono l&#39;abbondanza di proteine, suggerendo che gli eventi post-trascrizionali Si verificano per regolare le proteine ​​all&#39;interno delle cellule 1 , 2 . Inoltre, le proteine ​​infine dettano la funzione della cellula e quindi dettano il suo fenotipo, che può subire variazioni dinamiche in risposta ai fattori autocrini, paracrini e endocrini; Mediatori di sangue; temperatura; Trattamento farmacologico; E la malattia si sviluppament. Pertanto, un&#39;analisi di espressione incentrata sul livello della proteina è utile per caratterizzare il proteome e per svelare i cambiamenti critici che si verificano come parte della patogenesi della malattia 3 . Pertanto, le opportunità che la proteomica presenta per chiarire le condizioni della salute e delle malattie sono formidabili, nonostante le sfide tecnologiche esistenti. Le aree particolarmente promettenti di ricerca a cui la proteomica può contribuire comprendono: l&#39;individuazione dell&#39;espressione alterata di proteine ​​a qualsiasi livello ( cioè cellule intere o tessuti, compartimenti subcellulari e fluidi biologici); L&#39;identificazione, la verifica e la convalida di nuovi biomarcatori utili per la diagnosi e la prognosi della malattia; E, auspicabilmente, l&#39;individuazione di nuovi bersagli proteici che possono essere utilizzati per scopi terapeutici, nonché per la valutazione dell&#39;efficacia e della tossicità farmacologica 4 . Catturare la complessità diIl proteome rappresenta una sfida tecnologica. Gli attuali strumenti proteomici offrono l&#39;opportunità di eseguire analisi su larga scala e ad alto rendimento per l&#39;identificazione, la quantificazione e la convalida dei livelli alterati di proteine. Inoltre, l&#39;introduzione di tecniche di frazionamento e arricchimento, mirante ad evitare le interferenze causate dalle proteine ​​più abbondanti, ha anche migliorato l&#39;identificazione delle proteine ​​includendo le proteine ​​meno abbondanti. Infine, la proteomica è stata completata dall&#39;analisi delle modificazioni post-traduzionali, che emergono progressivamente come importanti modulatori della funzione proteica. Tuttavia, la preparazione del campione e il recupero delle proteine ​​nei campioni biologici in analisi rimangono ancora i passi limitanti nel flusso di lavoro proteomico e aumentano il potenziale di eventuali insidie 5 . Infatti, nella maggior parte delle tecniche di biologia molecolare che devono essere ottimizzate, i primi passi sono l&#39;omogeneizzazione dei tessutiIoni e cellule, soprattutto durante l&#39;analisi di proteine ​​a bassa abbondanza per le quali non esistono metodi di amplificazione. Inoltre, la natura chimica delle proteine ​​può influenzare il proprio recupero. Ad esempio, l&#39;analisi delle proteine ​​altamente idrofobiche è molto impegnativa, perché facilmente precipitano durante la messa a fuoco isoelettrica, mentre le proteine ​​di trans-membrana sono quasi insolubili (esaminate nel Reference 5). Inoltre, la variabilità della composizione tissutale crea una barriera significativa allo sviluppo di un metodo di estrazione universale. Infine, poiché quasi tutti gli esemplari clinici sono di quantità limitata, è essenziale consentire la preparazione di proteine ​​con il massimo recupero e riproducibilità da quantità minime di campioni 6 . Questo lavoro descrive un protocollo ottimizzato per l&#39;estrazione proteica dalla valvola mitrale normale cardiaca umana, che rappresenta un campione molto impegnativo per l&#39;analisi proteomica. La normale valvola mitrale è un compLex che si trova tra l&#39;atrio sinistro e il ventricolo sinistro del cuore ( Figura 1 ). Esso svolge un ruolo importante nel controllo del flusso di sangue dall&#39;atrio al ventricolo, impedendo il flusso di riflusso e assicurando il corretto livello di alimentazione dell&#39;ossigeno per tutto il corpo, mantenendo così un&#39;adeguata uscita cardiaca. Tuttavia, è spesso considerato un tessuto &quot;inattivo&quot;, con una bassa cellularità e pochi componenti, principalmente nella matrice extracellulare. Ciò è dovuto al fatto che, in condizioni normali, le cellule interstiziali valvolari residenti (VIC) presentano un fenotipo di riposo con una bassa percentuale di biosintesi proteica 7 . Tuttavia, è stato dimostrato che, in uno stato patologico, il numero di VICs nella spongiosa aumenta e la loro sintesi proteica è attivata, insieme ad altri cambiamenti funzionali e fenotipici 8 . Pertanto, non sorprende che i dati minimi disponibili inLa letteratura si concentra sull&#39;analisi delle valvole mitraliche patologiche 9 , 10 , in cui l&#39;aumento del numero di VIC attivato potrebbe spiegare il numero relativamente elevato di proteine ​​identificate. In conclusione, il presente protocollo può servire a sviluppare la comprensione dei meccanismi patogeni responsabili delle malattie delle valvole mitraliche attraverso lo studio di componenti proteici della valvola mitrale. Infatti, una maggiore comprensione dei processi patologici sottostanti potrebbe contribuire a migliorare la gestione clinica delle malattie delle valvole, le cui attuali indicazioni per l&#39;intervento sono in gran parte predicate sulle considerazioni emodinamiche.

<table><tbody><tr><td>Saline solution</td><td></td><td></td><td>0.9 % NaCl</td></tr><tr><td>Eurocollins A</td><td>SALF</td><td>30874046</td><td>Balanced organ&#039;s transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins</td></tr><tr><td>Eurocollins B</td><td>SALF</td><td>30874022</td><td>Balanced organ&#039;s transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins</td></tr><tr><td>Wisconsin</td><td>Bridge life</td><td>RM/N 4081</td><td>Balanced organ&#039;s transport medium</td></tr><tr><td>Biohazard vertical flow air</td><td>Burdinola</td><td></td><td>Class A GMP classification</td></tr><tr><td>Dewar Flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nalgene 4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cryogrinder system</td><td>OPS diagnostics</td><td>CG 08-01</td><td>Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver</td></tr><tr><td>Stainless steel forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel spatula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable sterile scalpel</td><td>Medisafe</td><td>MS-10</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel scissors</td><td></td><td></td><td>Autoclavable</td></tr><tr><td>Stainless steel picks</td><td></td><td></td><td>Autoclavable</td></tr><tr><td>Disposable sterile drap</td><td>Mon&amp;amp;Tex</td><td>3.307.08</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizing solution with isopropyl alcohol</td><td></td><td></td><td>70% isopropyl alcohol</td></tr><tr><td>Sterilizing solution with hydrogen peroxide</td><td></td><td></td><td>6% hydrogen peroxide</td></tr><tr><td>Micropipette, 1 mL, with tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td>VWR international</td><td>9278</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL centrifuge tubes</td><td>VWR international</td><td>PIER90410</td><td></td></tr><tr><td>Urea buffer</td><td></td><td></td><td>8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma aldrich</td><td>U6504-1KG</td><td>To be used for Urea buffer</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma aldrich</td><td>T8656</td><td>To be used for Urea buffer</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma aldrich</td><td>C3023-5GR</td><td>To be used for Urea buffer</td></tr><tr><td>Dithiotreitol</td><td>Sigma aldrich</td><td>D0632-5G</td><td>To be used for Urea buffer</td></tr><tr><td>Syringe 50 mL</td><td>PIC</td><td></td><td>To be used to filter Urea buffer</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>To be used to filter Urea buffer</td></tr><tr><td>PFTE Pestle, 2 mL</td><td>Kartell</td><td>6302</td><td>Part of Potter-Elvehjem homogenizer</td></tr><tr><td>Borosilicate glass mortar</td><td>Kartell</td><td>6102</td><td>Part of Potter-Elvehjem homogenizer</td></tr><tr><td>Stirrer</td><td>VELP scientifica</td><td>Stirrer DLH</td><td>To be used for homogenization by Potter-Elvehjem</td></tr><tr><td>Bradford Protein assay</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>Pbi International</td><td>F205</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene box</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td>For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g</td></tr><tr><td>Freezer -80&amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precision balance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td>For sterilization</td></tr><tr><td>Cryogenic gloves for liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Professional forced ventilation and natural air convection oven</td><td></td><td></td><td>For sterilization</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma aldrich</td><td>P8340-5ML</td><td>100X solution</td></tr><tr><td>ProteoExtract Protein Precipitation Kit</td><td>Calbiochem</td><td>539180</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>www.cytoscape.org</td><td>version 2.7</td><td>Software platform for Gene Ontology analysis</td></tr><tr><td>BiNGO</td><td>http://apps.cytoscape.org/apps/bingo</td><td>version 3.0.3</td><td>Plugin for Gene ontology analysis</td></tr><tr><td>AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-97494</td><td>Mouse monoclonal antibody against CryAB</td></tr><tr><td>Septin-11 Antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-83824</td><td>Rabbit polyclonal antibody against septin-11</td></tr><tr><td>FHL1 Antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP-188745</td><td>Rabbit polyclonal antibody against FHL-1</td></tr><tr><td>Dermatopontin Antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB110-68135</td><td>Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin</td></tr><tr><td>Goat Anti mouse IgG HRP</td><td>Sigma aldrich</td><td>A4416-0.5ML</td><td>Secondary antibody for immunoblotting</td></tr><tr><td>Goat Anti rabbit IgG HRP</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>170-5046</td><td>Secondary antibody for immunoblotting</td></tr></tbody></table>

optimized protocol for the extraction of proteins from the human mitral valve

L&#39;analisi del proteome cellulare può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari che sottostanno le malattie dovute allo sviluppo di tecnologie che permettono l&#39;identificazione e la quantificazione su larga scala delle proteine ​​presenti nei complessi sistemi biologici. Le conoscenze acquisite da un approccio proteomico possono portare a un Una migliore comprensione dei meccanismi patogeni che affrontano le malattie, consentendo l&#39;individuazione di nuovi marcatori di malattia diagnostici e prognostici e, speriamo, di obiettivi terapeutici. Tuttavia, la valvola cardiaca mitrale rappresenta un campione molto impegnativo per l&#39;analisi proteomica a causa della bassa mobilità in proteoglicano e matrice extracellulare ricca di collagene. Questo rende impegnativo estrarre le proteine ​​per un&#39;analisi proteomica globale. Questo lavoro descrive un protocollo compatibile con l&#39;analisi proteica successiva, come proteomica quantitativa e immunoblotting. Ciò può consentire la correlazione dei dati riguardantiG con dati sull&#39;espressione mRNA quantitativa e analisi immunoistochimica non-quantitativa. Infatti, questi approcci, se eseguiti insieme, porteranno ad una comprensione più completa dei meccanismi molecolari che stanno alla base di malattie, da mRNA a modifica della proteina post-traduzionale. Quindi, questo metodo può essere rilevante per i ricercatori interessati allo studio della fisiopatologia della valvola cardiaca.

L&#39;estrazione e la dissoluzione delle proteine ​​nel buffer urea è direttamente compatibile con i metodi proteomici basati su isoelectrofocusing (elettroforesi bidimensionale (2-DE) 11 e fuoco isoelettrico a fase liquida (IEF) 12 ) e con immunoblotting dopo la diluizione in tampone Laemmli 13 Contenente un cocktail inibitore della proteasi 14 . <p class="jove_content" fo:keep-toget...

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Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

La composizione proteica della valvola mitrale umana è ancora parzialmente sconosciuta, perché la sua analisi è complicata da basse cellularità e quindi da bassa biosintesi proteica. Questo lavoro fornisce un protocollo per estrarre efficacemente proteine ​​per l&#39;analisi della proteoma della valvola mitrale.

Protocollo ottimizzato per l&#39;estrazione delle proteine ​​dalla valvola mitrale umana

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

optimized-protocol-for-extraction-proteins-from-human-mitral

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.8K Views.  Centro Cardiologico Monzino IRCCS.  La composizione proteica della valvola mitrale umana è ancora parzialmente sconosciuta, perché la sua analisi è complicata da basse cellularità e quindi da bassa biosintesi proteica. Questo lavoro fornisce un protocollo per estrarre efficacemente proteine ​​per l'analisi della proteoma della valvola mitrale. 

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Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Ricerca

Biochimica

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative phosphorylation complexes encoded by the mitochondrial genome. Since all proteins synthesized by human mitoribosomes are integral membrane proteins, human mitoribosomes are tethered to the mitochondrial inner membrane during translation. Compared to the cytosolic ribosome the mitoribosome has a sedimentation coefficient of 55S, half the rRNA content, no 5S rRNA and 36 additional proteins. Therefore, a higher protein-to-RNA ratio and an atypical structure make the human mitoribosome substantially distinct from its cytosolic counterpart.
Despite the central importance of the mitoribosome to life, no protocols were available to purify the intact complex from human cell lines. Traditionally, mitoribosomes were isolated from mitochondria-rich animal tissues that required kilograms of starting material. We reasoned that mitochondria in dividing HEK293-derived human cells grown in nutrient-rich expression medium would have an active mitochondrial translation, and, therefore, could be a suitable source of material for the structural and biochemical studies of the mitoribosome. To investigate its structure, we developed a protocol for large-scale purification of intact mitoribosomes from HEK cells. Herein, we introduce nitrogen cavitation method as a faster, less labor-intensive and more efficient alternative to traditional mechanical shear-based methods for cell lysis. This resulted in preparations of the mitoribosome that allowed for its structural determination to high resolution, revealing the composition of the intact human mitoribosome and its assembly intermediates. Here, we follow up on this work and present an optimized and more cost-effective method requiring only ~1010 cultured HEK cells. The method can be employed to purify human mitoribosomal translating complexes, mutants, quality control assemblies and mitoribosomal subunits intermediates. The purification can be linearly scaled up tenfold if needed, and also applied to other types of cells.

Mitochondria have specialized ribosomes that diverged from their bacterial and cytoplasmic counterparts. Here we show how mitoribosomes can be obtained from their native compartment in HEK cells. The method involves isolation of mitochondria from suspension cells and consequent purification of mitoribosomes.

Rapido isolamento dei Mitoribosome da cellule HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

Dinamica proteomica e miRNA analisi di polisomi da Mouse cuore dopo Langendorff aspersione isolata

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

Elettroforesi ibrida trasparente/blu nativa per la separazione e l'analisi dei supercomplessi di catene respiratorie mitocondriali

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, mitochondria exist in a series of complex morphologies, ranging from small oval organelles to a broad, reticulum-like network. Understanding how the mitochondrial reticulum expands and develops in response to diverse stimuli such as alterations in energy demand has long been a topic of research. A key aspect of this growth, or biogenesis, is the import of precursor proteins, originally encoded by the nuclear genome, synthesized in the cytosol, and translocated into various mitochondrial sub-compartments. Mitochondria have developed a sophisticated mechanism for this import process, involving many selective inner and outer membrane channels, known as the protein import machinery (PIM). Import into the mitochondrion is dependent on viable membrane potential and the availability of organelle-derived ATP through oxidative phosphorylation. Therefore its measurement can serve as a measure of organelle health. The PIM also exhibits a high level of adaptive plasticity in skeletal muscle that is tightly coupled to the energy status of the cell. For example, exercise training has been shown to increase import capacity, while muscle disuse reduces it, coincident with changes in markers of mitochondrial content. Although protein import is a critical step in the biogenesis and expansion of mitochondria, the process is not widely studied in skeletal muscle. Thus, this paper outlines how to use isolated and fully functional mitochondria from skeletal muscle to measure protein import capacity in order to promote a greater understanding of the methods involved and an appreciation of the importance of the pathway for organelle turnover in exercise, health, and disease.

Mitochondria are key metabolic organelles that exhibit a high level of phenotypic plasticity in skeletal muscle. The import of proteins from the cytosol is a critical pathway for organelle biogenesis, essential for the expansion of the reticulum and the maintenance of mitochondrial function. Therefore, protein import serves as a barometer of cellular health.

Misurazione della capacità di importazione di proteine dei mitocondri del muscolo scheletrico

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento mitocondriale dai roditori per studi bioenergetici di alta qualità

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry to study metabolic impairments and disease. Consistent mitochondrial quality is necessary to properly investigate mitochondrial physiology and bioenergetics; however, many different published isolation methods are available for researchers. Although different experimental strategies require different isolation methods, the basic principles and procedures are similar. This protocol details a method capable of extracting well-coupled mitochondria from a variety of tissue sources, including small animals and cells. The steps outlined include organ dissection, mitochondrial purification, protein quantification, and various quality control checks. The primary quality control metric used to identify high-quality mitochondria is the respiratory control ratio (RCR). The RCR is the ratio of the respiratory rate during oxidative phosphorylation to the rate in the absence of ADP. Alternative metrics are discussed. While high RCR values relative to their tissue source are obtained using this protocol, several steps can be optimized to suit the individual needs of researchers. This procedure is robust and has consistently resulted in isolated mitochondria with above-average RCR values across animal models and tissue sources.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Scoprire il ruolo del fosfato di calcio mitocondriale nell'insufficienza cardiaca e nella bioenergetica

Bioenergetic and metabolomic studies on mitochondria have revealed their multifaceted role in many diseases, but the isolation methods for these organelles vary. The method detailed here is capable of purifying high-quality mitochondria from multiple tissue sources. Quality is determined by respiratory control ratios and other metrics assessed with high-resolution respirometry.

Robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori 

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Biologia

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Proteine ​​Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Protocollo ottimizzato per l'estrazione delle proteine dalla valvola mitrale umana

Riepilogo

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Robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori

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Proteine Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione

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