Çoğunlukla birincil kirpikler yoluyla iletilen Sonic Hedgehog sinyalini değerlendirmek için kullanılabilecek hücre kültürüne dayalı hassas ve kantitatif bir test geliştirdik. Bu test, primer silia disfonksiyonu ile ilişkili genetik ve epigenetik değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Sonic Hedgehog sinyalizasyonunda primer kirpiklerin merkezi rolüne rağmen, mevcut metodolojiler genellikle genetik değişiklikler altında primer kirpiklerin işlevini değerlendirmek için gereken hassasiyetten yoksundur.
Bu protokol, kirpikli hücrelerde Sonic Hedgehog aktivasyonunu ve Sonic Hedgehog hedef gen ekspresyonunu taklit eden hücre kültürü tabanlı bir test sağlayarak bu boşluğu doldurur. Sonic Hedgehog yolunun aktivasyonu üzerine birincil kirpikler boyunca düzleştirilmiş proteinin lokalizasyonu gibi diğer protokollerle karşılaştırıldığında, testimiz hücre kültürü tabanlı olduğu için kantitatif, takip etmesi kolay ve hassastır. Başlamak için, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörden beş mililitre tam ortamda büyüyen neredeyse birleşen RPE-1 hücreleri içeren T25 hücre kültürü şişesini çıkarın.
Kültür ortamını hücre kültürü şişesinden atın ve hücreleri önceden ısıtılmış %0.25'lik bir tripsin-EDTA çözeltisinin enzimatik aktivitesi ile yerinden çıkarın. Önceden ısıtılmış tam bir ortam kullanarak hücreleri bir şişede yeniden süspanse edin. Süspansiyonun hücre yoğunluğunu belirlemek için hücreleri bir hemositometre üzerinde sayın.
İki adet steril 12 milimetrelik örtü fişini iki adet 35 milimetrelik hücre kültürü kabına yerleştirin. Kapak fişleri içeren her tabakta eşzamansız olarak büyüyen beş RPE-1 hücresinin gücüne iki kez 10 tohum atın. Her yemeğe iki mililitre tam ortam ekleyin ve hücreleri 24 saat boyunca büyütün.
İnkübasyondan sonra, ortamı büyüyen RPE-1 hücrelerinden çıkarın ve hücreleri bir mililitre önceden ısıtılmış DPBS tamponu ile bir kez yıkayın. Her yemeğe FBS içermeyen% 1 penisilin streptomisin içeren iki mililitre önceden ısıtılmış DMEM ortamı ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Ertesi gün, besiyerini 250 nanomolar nihai konsantrasyonda düzleştirilmiş bir agonist içeren serumdan aç bir besiyeri ile değiştirin. Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat daha inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kapak fişlerini 24 oyuklu bir plakaya aktarın ve her oyuğa bir kapak fişi yerleştirin.
Hücreleri sabitlemek için her oyuğa 0,5 mililitre soğutulmuş metanol ekleyin. Plakayı eksi 20 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Kapak fişlerini hemen 0,5 mililitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.
Ortamı bulaşıklardan atın. Her yemeğe doğrudan 0,5 mililitre TRIzol Reaktifi ekleyin. Reaktifi eşit olarak dağıtın ve beş dakika bekletin.
Homojen bir karışım oluşturmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 1.5 mililitrelik, nükleaz içermeyen mikrosantrifüj tüplerinde toplayın Düzleştirilmiş bir agonist ve DMSO ile muamele edilmiş TRİZOL ile karıştırılmış hücreler içeren her tüpe 0.1 mililitre kloroform ekleyin. Dört santigrat derecede 12.000 g'da santrifüjlemeden önce tüpleri iki ila üç dakika inkübe edin. RNA'yı içeren sulu fazı taze mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
Sulu faza 0.25 mililitre izopropanol ekleyin ve tüpleri 10 dakika inkübe edin. Numuneleri 12.000 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Beyaz jel benzeri bir RNA topağının oluşumunu gözlemleyin.
Süpernatanı bir mikropipet kullanarak dikkatlice atın. Ardından, RNA peletini 0,5 mililitre taze seyreltilmiş %75 etanol içinde yeniden süspanse edin. Karıştırmayı sağlamak için tüpleri kısaca girdaplayın.
Numuneleri 7.500 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir mikropipet kullanarak dikkatlice atın. RNA peletlerini 10 dakika havayla kurutun.
Peletleri 25 mikrolitre nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin. 260 nanometrede bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak toplam RNA konsantrasyonunu ölçün. Üreticinin bir cDNA Sentez Kiti talimatlarını izleyerek cDNA'yı sentezlemek için her numuneden bir ila üç mikrogram toplam RNA kullanın.
GLI1, PTCH1, HHIP, SMO ve beta-aktin genlerinin primer setleri ile her numuneden bire beş seyreltilmiş cDNA kullanarak qPCR reaksiyonlarını üç katlı, floresana duyarlı bir PCR plakasında bir qPCR ana karışımı ile ayarlayın. PCR plakasını uygun bir sızdırmazlık maddesi ile kapatın. Plakayı bir qPCR cihazına yerleştirin.
Standartlaştırılmış qPCR programını 40 amplifikasyon döngüsü ile çalıştırın ve ardından bir erime eğrisi analizi yapın. Çalıştırmadan sonra, istenen sıcaklıkta tek bir tepe noktası için her bir amplikonun erime eğrisini kontrol edin. Amplifikasyon verilerini bir elektronik tabloya aktarın.
Beta-aktin ekspresyonuna karşı normalleştirerek her transkriptin göreceli ifadesini hesaplayın, göreceli ifade verilerini bir grafik üzerinde çizin ve eşleşmemiş bir t-testi kullanarak ifadedeki değişikliklerin istatistiksel anlamlılığını hesaplayın. Seruma aç kalan hücrelerin çoğu, %85'ten fazla siliasyon ile primer kirpikleri bir araya getirdi. Bu durumda, GLI1, PTCH1 ve HHIP ekspresyon seviyeleri, DMSO ile tedavi edilen hücrelere kıyasla pürüzsüz agonist ile tedavi edilen hücrelerde önemli ölçüde artarken, SMO transkript seviyeleri önemli bir değişiklik göstermedi.
