우리는 대부분 1차 섬모를 통해 전달되는 Sonic Hedgehog 신호 전달을 평가하는 데 사용할 수 있는 세포 배양 기반의 민감하고 정량적인 분석을 개발했습니다. 이 분석법은 원발성 섬모 기능 장애와 관련된 유전적 및 후성유전학적 변화를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 소닉 헤지혹 신호전달에서 1차 섬모의 중심적인 역할에도 불구하고, 현재의 방법론은 종종 유전적 변형에서 1차 섬모의 기능을 평가하는 데 필요한 민감도가 부족합니다.
이 프로토콜은 섬모 세포에서 Sonic Hedgehog 활성화 및 Sonic Hedgehog 표적 유전자 발현을 모방하여 세포 배양 기반 분석을 제공함으로써 이러한 격차를 메웁니다. Sonic Hedgehog 경로 활성화 시 원발성 섬모를 따라 평활화된 단백질의 국소화와 같은 다른 프로토콜과 비교하여, 당사의 분석은 세포 배양 기반이기 때문에 정량적이고 따르기 쉬우며 민감합니다. 먼저 섭씨 37도 및 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 5밀리리터의 완전한 배지에서 성장하는 거의 합류에 가까운 RPE-1 세포가 들어 있는 T25 세포 배양 플라스크를 제거합니다.
세포 배양 플라스크에서 배양 배지를 버리고 예열된 0.25% 트립신-EDTA 용액의 효소 활성으로 세포를 제거합니다. 예열된 완전한 배지를 사용하여 플라스크에 세포를 재현탁합니다. 혈구계에서 세포를 계수하여 현탁액의 세포 밀도를 확인합니다.
두 개의 멸균 12mm 커버 슬립을 두 개의 35mm 세포 배양 접시에 넣습니다. 커버 슬립이 포함된 각 접시에 비동기식으로 성장하는 RPE-1 세포 5개의 거듭제곱에 10을 두 번 파종합니다. 각 접시에 2ml의 완전 배지를 넣고 24시간 동안 세포를 성장시킵니다.
배양 후, 성장하는 RPE-1 세포에서 배지를 제거하고 1ml의 예열된 DPBS 완충액으로 세포를 한 번 세척합니다. FBS가 없는 1%페니실린 스트렙토마이신이 함유된 예열 DMEM 배지 2ml를 각 접시에 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
다음날, 배지를 250 나노몰의 최종 농도에서 평활화된 작용제를 함유한 혈청이 부족한 배지로 교체하십시오. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 더 세포를 배양합니다. 배양 후 커버 슬립을 24웰 플레이트로 옮기고 각 웰에 하나의 커버 슬립을 배치합니다.
각 웰에 0.5ml의 냉각된 메탄올을 첨가하여 세포를 고정합니다. 접시를 섭씨 영하 20도에서 10분 동안 배양합니다. 즉시 0.5ml의 세척 버퍼로 커버가 미끄러지면 세 번 세탁하십시오.
접시에서 매체를 버리십시오. 0.5ml의 TRIzol 시약을 각 접시에 직접 첨가합니다. 시약을 고르게 분배하고 5분 동안 그대로 두십시오.
위아래로 몇 차례 피펫팅하여 균일한 혼합물을 만들고 1.5ml의 뉴클레아제가 없는 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.평활화된 작용제와 DMSO로 처리된 TRIzol 혼합 세포가 포함된 각 튜브에 0.1ml의 클로로포름을 추가합니다. 12, 000g에서 섭씨 4도에서 원심분리하기 전에 튜브를 2-3분 동안 배양합니다. RNA를 포함하는 수성상을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 전달합니다.
수성상에 0.25ml의 이소프로판올을 첨가하고 튜브를 10분 동안 배양합니다. 12, 섭씨 4도에서 10분 동안 000g으로 샘플을 원심분리하십시오. 흰색 젤 같은 RNA 펠릿의 형성을 관찰하십시오.
마이크로피펫을 사용하여 상등액을 조심스럽게 폐기합니다. 그런 다음 RNA 펠릿을 갓 희석한 75% 에탄올 0.5ml에 재현탁합니다. 혼합을 보장하기 위해 튜브를 짧게 소용돌이치십시오.
7, 500g에서 섭씨 4도에서 5분 동안 샘플을 원심분리하십시오. 마이크로피펫을 사용하여 상등액을 조심스럽게 폐기합니다. RNA 펠릿을 10분 동안 자연 건조합니다.
펠릿을 뉴클레아제가 없는 물 25마이크로리터에 재현탁합니다. 260나노미터에서 미량 분광 광도계를 사용하여 총 RNA 농도를 측정합니다. cDNA 합성 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 각 샘플에서 1-3마이크로그램의 총 RNA를 사용하여 cDNA를 합성합니다.
GLI1, PTCH1, HHIP, SMO 및 베타-액틴 유전자의 프라이머 세트가 있는 각 샘플에서 1-5개의 희석된 cDNA를 사용하여 qPCR 반응을 멀티 웰, 형광성 감응성 PCR 플레이트에 담아 qPCR 반응을 3회로 설정합니다. PCR 플레이트를 적절한 밀봉기로 덮습니다. 플레이트를 qPCR 기기에 넣습니다.
40회의 증폭 주기로 표준화된 qPCR 프로그램을 실행한 후 용융 곡선 분석을 수행합니다. 실행 후 원하는 온도에서 단일 피크에 대한 각 앰플리콘의 용융 곡선을 확인합니다. 증폭 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
베타-액틴 발현에 대해 정규화하여 각 전사체의 상대 발현을 계산하고, 상대 발현 데이터를 그래프에 표시하고, 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 발현 변화의 통계적 유의성을 계산합니다. 혈청이 부족한 대부분의 세포는 85% 이상의 섬모로 원발성 섬모를 조립했습니다. 이 조건에서 GLI1, PTCH1 및 HHP의 발현 수준은 DMSO 처리 세포에 비해 부드러운 작용제 처리 세포에서 유의하게 증가한 반면 SMO 전사체 수준은 유의한 변화를 나타내지 않았습니다.
