Nous avons mis au point un test sensible et quantitatif basé sur la culture cellulaire qui peut être utilisé pour évaluer la signalisation Sonic Hedgehog, qui est transduite principalement via les cils primaires. Ce test peut être utilisé pour examiner les altérations génétiques et épigénétiques, qui sont associées à un dysfonctionnement primaire des cils. Malgré le rôle central des cils primaires dans la signalisation de Sonic Hedgehog, les méthodologies actuelles manquent souvent de la sensibilité nécessaire pour évaluer la fonction des cils primaires sous des altérations génétiques.
Ce protocole comble cette lacune en fournissant un test basé sur la culture cellulaire, imitant l’activation de Sonic Hedgehog et l’expression du gène cible de Sonic Hedgehog dans les cellules ciliées. En comparaison avec d’autres protocoles, tels que la localisation de protéines lissées le long des cils primaires lors de l’activation de la voie Sonic Hedgehog, notre test est quantitatif, facile à suivre et sensible car il est basé sur la culture cellulaire. Pour commencer, retirez le flacon de culture cellulaire T25 contenant des cellules RPE-1 presque confluentes se développant dans cinq millilitres de milieu complet à partir d’un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.
Jetez le milieu de culture du ballon de culture cellulaire et délogez les cellules avec l’activité enzymatique d’une solution préchauffée à 0,25 % de trypsine-EDTA. Remettre les cellules en suspension dans une fiole à l’aide d’un milieu complet préchauffé. Comptez les cellules sur un hémocytomètre pour déterminer la densité cellulaire de la suspension.
Placez deux lamelles stériles de 12 millimètres dans deux boîtes de culture cellulaire de 35 millimètres. Grainez deux fois 10 à la puissance de cinq cellules RPE-1 à croissance asynchrone dans chaque plat contenant des lamelles. Ajoutez deux millilitres de milieu complet dans chaque plat et faites croître les cellules pendant 24 heures.
Après l’incubation, retirez le milieu des cellules RPE-1 en croissance et lavez les cellules une fois avec un millilitre de tampon DPBS préchauffé. Ajoutez deux millilitres de milieu DMEM préchauffé contenant 1 % de pénicilline streptomycine sans FBS dans chaque plat. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.
Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu affamé de sérum contenant un agoniste lissé à une concentration finale de 250 nanomolaires. Incuber les cellules pendant encore 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation, transférez les lamelles dans une plaque à 24 puits, en plaçant une lamelle dans chaque puits.
Ajoutez 0,5 millilitre de méthanol réfrigéré dans chaque puits pour fixer les cellules. Incuber l’assiette à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes. Lavez immédiatement les lamelles de couverture trois fois avec 0,5 millilitre de tampon de lavage.
Jetez le milieu de la vaisselle. Ajoutez 0,5 millilitre de réactif TRIzol directement dans chaque plat. Répartissez uniformément le réactif et laissez-le reposer pendant cinq minutes.
Pipetez de haut en bas plusieurs fois pour créer un mélange homogène et recueillez-le dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, sans nucléases. Ajoutez 0,1 millilitre de chloroforme à chaque tube contenant des cellules mélangées à TRIzol traitées avec un agoniste lissé et du DMSO. Incuber les tubes pendant deux à trois minutes avant de les centrifuger à 12 000 g à quatre degrés Celsius. Transférez la phase aqueuse contenant l’ARN dans des tubes de microcentrifugation frais.
Ajoutez 0,25 millilitre d’isopropanol à la phase aqueuse et incubez les tubes pendant 10 minutes. Centrifugez les échantillons à 12 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Observez la formation d’une pastille d’ARN blanche semblable à un gel.
Jeter délicatement le surnageant à l’aide d’une micropipette. Ensuite, mettez en suspension la pastille d’ARN dans 0,5 millilitre d’éthanol à 75 % fraîchement dilué. Agiter brièvement les tubes pour assurer le mélange.
Centrifugez les échantillons à 7 500 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter délicatement le surnageant à l’aide d’une micropipette. Faites sécher les granules d’ARN à l’air libre pendant 10 minutes.
Remettez les granulés en suspension dans 25 microlitres d’eau sans nucléases. Mesurez la concentration totale d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume à 260 nanomètres. Utilisez un à trois microgrammes d’ARN total de chaque échantillon pour synthétiser l’ADNc en suivant les instructions du fabricant pour un kit de synthèse d’ADNc.
Configurez les réactions qPCR en trois exemplaires à l’aide d’un à cinq ADNc dilué de chaque échantillon avec des ensembles d’amorces de gènes GLI1, PTCH1, HHIP, SMO et bêta-actine, avec un mélange maître qPCR dans une plaque PCR multi-puits sensible à la fluorescence. Couvrez la plaque PCR avec un scellant approprié. Placez la plaque dans un instrument de qPCR.
Exécutez le programme qPCR standardisé avec 40 cycles d’amplification, suivis d’une analyse de la courbe de fusion. Après l’essai, vérifiez la courbe de fusion de chaque amplicon pour un seul pic à la température souhaitée. Exportez les données d’amplification vers une feuille de calcul.
Calculez l’expression relative de chaque transcrit en normalisant par rapport à l’expression de la bêta-actine, tracez les données d’expression relative sur un graphique et calculez la signification statistique des changements d’expression à l’aide d’un test t non apparié. La plupart des cellules affamées de sérum ont assemblé des cils primaires avec plus de 85 % de ciliation. Dans cette condition, les niveaux d’expression de GLI1, PTCH1 et HHIP ont été significativement augmentés dans les cellules lisses traitées par agoniste par rapport aux cellules traitées au DMSO, tandis que les niveaux de transcription SMO n’ont montré aucun changement significatif.
