Abbiamo sviluppato un saggio sensibile e quantitativo basato su colture cellulari che può essere utilizzato per valutare la segnalazione di Sonic Hedgehog, che viene trasdotta principalmente attraverso le ciglia primarie. Questo test può essere utilizzato per esaminare le alterazioni genetiche ed epigenetiche, che sono associate alla disfunzione delle ciglia primarie. Nonostante il ruolo centrale delle ciglia primarie nella segnalazione di Sonic Hedgehog, le metodologie attuali spesso mancano della sensibilità necessaria per valutare la funzione delle ciglia primarie in presenza di alterazioni genetiche.
Questo protocollo colma questa lacuna fornendo un saggio basato su colture cellulari, imitando l'attivazione di Sonic Hedgehog e l'espressione genica bersaglio di Sonic Hedgehog nelle cellule ciliate. Rispetto ad altri protocolli, come la localizzazione di proteine levigate lungo le ciglia primarie dopo l'attivazione della via Sonic Hedgehog, il nostro test è quantitativo, facile da seguire e sensibile in quanto basato su colture cellulari. Per iniziare, rimuovere il pallone di coltura cellulare T25 contenente cellule RPE-1 quasi confluenti che crescono in cinque millilitri di terreno completo da un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Scartare il terreno di coltura dal pallone di coltura cellulare e rimuovere le cellule con l'attività enzimatica di una soluzione preriscaldata di tripsina-EDTA allo 0,25%. Risospendere le cellule in un matraccio utilizzando un mezzo completo preriscaldato. Contare le cellule su un emocitometro per determinare la densità cellulare della sospensione.
Posizionare due vetrini sterili da 12 millimetri in due piastre per colture cellulari da 35 millimetri. Semina due volte 10 alla potenza di cinque cellule RPE-1 a crescita asincrona in ogni piatto contenente vetrini coprioggetti. Aggiungere due millilitri di terreno completo a ogni piatto e far crescere le cellule per 24 ore.
Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno dalle cellule RPE-1 in crescita e lavare le cellule una volta con un millilitro di tampone DPBS preriscaldato. Aggiungere due millilitri di terreno DMEM preriscaldato contenente l'1% di penicillina streptomicina senza FBS a ogni piatto. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore.
Il giorno successivo, sostituire il terreno con un terreno affamato di siero contenente un agonista levigato a una concentrazione finale di 250 nanomolari. Incubare le cellule per altre 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, trasferire i vetrini copricoperchio in una piastra a 24 pozzetti, posizionando un vetrino copricoperchio in ciascun pozzetto.
Aggiungere 0,5 millilitri di metanolo refrigerato in ogni pozzetto per fissare le cellule. Incubare la piastra a meno 20 gradi Celsius per 10 minuti. Lavare immediatamente i vetrini coprioggetto tre volte con 0,5 millilitri di tampone di lavaggio.
Scartare il terreno dai piatti. Aggiungere 0,5 millilitri di reagente TRIzol direttamente in ogni piatto. Distribuire uniformemente il reagente e lasciarlo riposare per cinque minuti.
Pipettare su e giù alcune volte per creare una miscela omogenea e raccoglierla in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri prive di nucleasi Aggiungere 0,1 millilitri di cloroformio a ciascuna provetta contenente cellule miscelate con TRIzol trattate con un agonista levigato e DMSO. Incubare le provette per due o tre minuti prima di centrifugare a 12.000 g a quattro gradi Celsius. Trasferire la fase acquosa contenente l'RNA in provette fresche per microcentrifuga.
Aggiungere 0,25 millilitri di isopropanolo alla fase acquosa e incubare le provette per 10 minuti. Centrifugare i campioni a 12.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Osservare la formazione di un pellet di RNA bianco gelatinoso.
Eliminare con cura il surnatante utilizzando una micropipetta. Quindi, risospendere il pellet di RNA in 0,5 millilitri di etanolo al 75% appena diluito. Agitare brevemente i tubi per garantire la miscelazione.
Centrifugare i campioni a 7.500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Eliminare con cura il surnatante utilizzando una micropipetta. Asciugare all'aria i pellet di RNA per 10 minuti.
Risospendere i pellet in 25 microlitri di acqua priva di nucleasi. Misurare la concentrazione totale di RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi a 260 nanometri. Utilizzare da uno a tre microgrammi di RNA totale da ciascun campione per sintetizzare il cDNA seguendo le istruzioni del produttore per un kit di sintesi del cDNA.
Impostare le reazioni qPCR in triplicato utilizzando cDNA diluito da uno a cinque da ciascun campione con set di primer di geni GLI1, PTCH1, HHIP, SMO e beta-actina, con una master mix qPCR in una piastra PCR multi-pozzetto sensibile alla fluorescenza. Coprire la piastra PCR con un sigillante adatto. Posizionare la piastra in uno strumento qPCR.
Eseguire il programma qPCR standardizzato con 40 cicli di amplificazione, seguiti da un'analisi della curva di fusione. Dopo la corsa, controllare la curva di fusione di ciascun amplicone per un singolo picco alla temperatura desiderata. Esporta i dati di amplificazione in un foglio di calcolo.
Calcola l'espressione relativa di ogni trascritto normalizzando l'espressione rispetto all'espressione della beta-actina, traccia i dati di espressione relativa su un grafico e calcola la significatività statistica dei cambiamenti nell'espressione utilizzando un test t spaiato. La maggior parte delle cellule affamate di siero ha assemblato ciglia primarie con più dell'85% di ciliazione. In questa condizione, i livelli di espressione di GLI1, PTCH1 e HHIP erano significativamente aumentati nelle cellule trattate con agonisti lisci rispetto alle cellule trattate con DMSO, mentre i livelli di trascrizione SMO non hanno mostrato cambiamenti significativi.
