Bu çalışma Ulusal Göz Enstitüsü (NEI), Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) fonu R01 EY029751-04 tarafından desteklenmiştir. Dr. Sylvia B. Smith'e teşekkür ederiz, çünkü bu protokol Müller hücre izolasyonu protokolüne dayalı olarak değiştirilmiş versiyondur.

Hayvanlarla yapılan tüm deneyler, Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO beyanına uygundur ve Hayvan Bakımı ve Kullanımı Enstitüsü Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan hayvan protokolümüze ve Oakland Üniversitesi politikalarına (protokol numarası 2022-1160) göre yapılmıştır
1. Besiyeri ve çözelti hazırlama
<ol><li>Dulbecco Modifiye Eagle Medium'u (DMEM, detaylar malzeme tablosunda) 1:1000 seyreltmede penisilin / streptomisin ile destekleyerek Müller hücre gözü solüsyonunu hazırlayın. Örneğin, 10 mL DMEM için 10 μL penisilin / streptomisin ekleyin. NOT: Bu, hazırlanmış basit bir serumsuz ortamdır. Ayrıca, hücre kültürü çalışması için kullanmadan önce tüm ortamı 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.</li>
	<li>DMEM'i %10 Fetal Sığır Serumu (FBS, ısıyla inaktive edilmiş) ve %1 penisilin / streptomisin ile destekleyerek tam birincil Müller hücre büyüme ortamını hazırlayın. Örneğin (500 mL DMEM ortamı + 50 mL FBS + 5 mL penisilin / streptomisin).</li>
	<li>200 U/mL konsantrasyonda Kollajenaz IV ile% 0.05'lik bir Tripsin-EDTA çözeltisi hazırlayın (Tripsin-EDTA, gerekli konsantrasyona ulaşmak için hesaplanan Kollajenaz IV tozu miktarını çözmek için kullanılır).</li>
</ol>2. Enükleasyon
<ol><li>IACUC yönergelerini izleyerek CO2 inhalasyonu kullanarak fareyi etik olarak ötenazi yapın.<ol><li>Kısaca, farelere minimum sıkıntı ile 2-3 dakika içinde hızlı bilinç kaybı hedefine ulaşmak için CO2 ile oda hacminin / dakikasının% 30-70'i doluluk oranında% 100 CO2 vermek için hayvanları CO 2 odasına yerleştirin.</li>
		<li>Fareler genç yaşta (~ 10 gün) olduğundan, uygun ötenaziyi sağlamak için ikincil bir yöntem olarak servikal çıkık yapın.</li>
	</ol></li>
	<li>Çalışma alanını %70 etanol ile sterilize ettikten sonra, fareyi steril bir alt ped üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Cımbızın kollarını gözün arkasına yerleştirerek, orbital bölgeden nazikçe çekerek ve proptoza neden olmak için orbital alana 5/45 tarzı cımbızla baskı uygulayarak gözleri enükleize ederek gözleri çıkarın. NOT: Diseksiyondan önce diseksiyon aletlerini %70 etanol ve ardından fosfat tampon salin ile sterilize edin.</li>
	<li>Gözü yavaşça enüklee ederek optik sinirin hala göze bağlı olduğundan emin olun. Optik siniri (görsel olarak beyaz kordon olarak tanımlanır) gözün arkasına çektiğinizden emin olun. NOT: Bu adımın mikroskop altında gerçekleştirilmesine gerek yoktur ve sterilize edilmiş bir tezgahta gerçekleştirilebilir.</li>
</ol>3. Enükleasyonlu gözlerin tedavisi
<ol><li>15 mL'lik bir santrifüj tüpünü alüminyum folyo ile örtün ve tüpü 10 mL Müller hücre gözü solüsyonu ile doldurun.</li>
	<li>Diseke edilmiş gözleri Müller hücre göz solüsyonu içeren 15 mL'lik tüpe yerleştirin ve gece boyunca veya yaklaşık 18 saat oda sıcaklığında bekletin.</li>
	<li>18 saat sonra, göz solüsyonunu boşaltın ve gözleri 2-3 mL ısıtılmış (37 ° C) fosfat tamponlu salin (PBS) ile kısa bir süre durulayın.</li>
	<li>PBS'yi boşaltın ve gözleri 10 mL tripsin çözeltisi içeren 100 mm'lik bir Petri kabına taşıyın. (adım 1.3'te hazırlanmıştır). NOT: Tripsin, diseksiyon sırasında retina katmanlarından hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için dissosiyatif bir ajan olarak işlev gören tüm enükleasyonlu gözde kullanılır. Diseke retina, yapışkan olan ve Müller hücre kültürünü kontamine etme olasılığı en yüksek olan RPE hücreleri de dahil olmak üzere birçok hücreye sahiptir14. Mikroskobik inceleme, 5 günlük izolasyondan sonra (ilk ortam değişikliği sırasında), RPE hücrelerinin plakadan ayrıldığını ve13 öldüğünü açıkça gösterdi. RPE izolasyonu için kullanılan ortam, sodyum piruvat ve düşük glikoz içeren DMEM'den (Müller hücre izolasyonunda kullanılan) farklı bir bileşime sahip DMEM/F-12'dir.</li>
	<li>Çanağı bir kuluçka makinesine koyun ve 37 ° C ve% 5 CO2'de 1,5 ila 2 saat inkübe edin.</li>
	<li>İnkübe ettikten sonra, gözleri yaklaşık 5 mL tam primer Müller hücre büyüme ortamı içeren 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın.</li>
</ol>4. Diseksiyon
NOT: Bu prosedür, kültür başlığının steril ortamında gerçekleştirilmelidir. Bu nedenle, davlumbaz yüzeylerinin tüm aletler ve diseksiyon mikroskobu ile birlikte %70 alkol ile iyice sterilize edilmesi önemlidir. Videonun daha iyi görünürlük ve daha net gösterim amaçları için kaputun dışında kaydedildiğini belirtmekte fayda var.
<ol><li>Diseksiyon sırasında gözleri stabilize etmeye yardımcı olmak için tabağa küçük bir parça sterilize edilmiş laboratuvar sınıfı doku yerleştirin. Diseksiyonu başlatmak için gözleri diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. NOT: Laboratuvar sınıfı doku kullanımı, gözlerin sıvı dolu bir kapta (tam ortam) manevra yapmasını kolaylaştırarak hassas diseksiyon sağlar.</li>
	<li>Bağ dokusunu, göz dışı kasları ve optik siniri çıkarmak için Vannas makası ve M5S tarzı cımbız kullanın.<ol><li>M5S tarzı cımbızla gözü kavrayın ve Vannas makas veya şırınga iğnesi ile ora serrata bölümünde bir kesi yapın. NOT: Gözün ön ve arka kısmı arasında ora serrata adı verilen açık mavi dairesel bir çizgi vardır ve bu, diseksiyon sırasında doğru yönlendirme için bir yer işareti olarak kullanılabilir.</li>
		<li>Kesi aletini M5S tarzı cımbızla kavrayın ve korneayı gözün arka kısmından çekin veya yırtın. Retinanın bütünlüğünün bozulmadan kalmasını sağlamak için küçük artışlarla çekin. NOT: Bu adımlar, gözün ön kısmını (Kornea, İris ve Lens) göz kabının arka kısmından (nöral ve pigmentli retinalar) çıkarmak içindir.</li>
		<li>Retina katmanlarının bütünlüğünü korumak için, retina pigmentli epiteli nazikçe çekin ve nöral retinadan çıkarın. RPE tabakası genellikle yapışkan olduğundan ve nöronal retinaya bağlı olduğundan, izolasyonun saflığını mümkün olduğunca sağlamak için nöral retinada herhangi bir siyah leke bulunmamalıdır.</li>
		<li>Hücrelerin plaka üzerinde homojen bir şekilde yayılmasını sağlamak için diseke edilen nöral retinayı bir plakada toplamadan önce küçük parçalara ayırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Nöral retinaları, 4 mL tam primer Müller hücre büyüme ortamı içeren bir T25 şişesinde plakalayın.</li>
	<li>Son olarak, şişeyi bir inkübatöre yerleştirin ve 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
</ol>5. Primer Müller glial hücrelerinin kültürlenmesi
<ol><li>Hücre büyümesini teşvik etmek için şişeyi 3-5 gün boyunca hareket ettirmeyin.</li>
	<li>Beşinci günden sonra ve daha sonra hücreler% 90 birleşene kadar her gün ortamı değiştirin.</li>
</ol>6. Primer Müller glial hücrelerinin pasajı
<ol><li>Müller hücre kültürü ortamını aspire edin, ardından PBS'de 2 mL yıkayın ve PBS'yi aspire edin. 2 mL% 0.25 Tripsin-EDTA (1x) veya plakayı kaplayacak kadar ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5-10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Hücrelerin mikroskop altında plakadan ayrıldığından emin olun. Daha sonra, hücre süspansiyonunu toplayın ve toplama tüpüne 4 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) tam birincil Müller hücre büyüme ortamı (adım 1.2'de hazırlanmıştır) ekleyin.</li>
	<li>300 x g'da 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire ettikten sonra, peleti 10 mL tam birincil Müller hücre büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Hücre sayısı diseke edilen göz sayısına göre değişebildiğinden, tohumlama ve inkübasyondan önce hücreleri saymak daha iyidir. Önerilen tohumlama yoğunluğu, bir T75 şişesinde 3.0 x10 6 hücredir. NOT: Hücreler 4-5 defaya kadar geçirilebilir. Bununla birlikte, en tutarlı deney sonuçları 1-2 pasajdan sonra bulunur.</li>
</ol>7. İmmünofloresan
NOT: Müller hücre özgüllüğünü boyamak ve doğrulamak için immünofloresan protokolünü kullanın. İşte immünofloresan protokolüne kısa bir genel bakış. Bu adım, ilk pasajdan12 sonra gerçekleştirilir.
<ol><li>Hücreleri bir Hücre Kültürü Odası Slaytına tohumlayın (8 oyuklu bir oda slaytı için oyuk başına 30.000 hücre).</li>
	<li>İzole edilen hücreleri 24-48 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de tam bir Müller hücre kültürü ortamında (adım 1.2'de hazırlanan) kültürleyin.</li>
	<li>Ortamı aspire edin ve hücreler% 80-90 birleştiğinde hazne slaytını her bir kuyucukta 250-300 μL 1x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Slaytı her bir oyukta 250-300 μL% 4 paraformaldehit içinde 10 ila 15 dakika sabitleyin, ardından PBS / TX-100 (her biri 5 dakika / 3x) ile yıkayın.</li>
	<li>37 ° C'de 1 saat boyunca engelleme tamponu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Bloke edici çözeltiyi aspire edin, ardından glutamin sentetaz ve vimentin 5,12 kullanarak izole edilen hücrelerin saflığını doğrulamak için Müller hücrelerine özgü birincil antikorları ekleyin. 37 ° C'de 3 saat inkübe edin (150-200 μL / slayt hacminde bloke edici tamponda 1: 100-1: 200 antikor konsantrasyonu kullanılarak). Slaytı PBS/TX-100 yıkamalarla yıkayın (her biri 5 ve 10 dakika). NOT: Bu antikorlar, Müller hücrelerini tanımlamak ve Müller hücre kültürünün başarısını ve saflığını sağlamak için ayırt edici özellikler oldukları için seçilmiştir.</li>
	<li>İkincil antikoru ekleyin (150-200 μL/slaytta bloke edici tamponda 1:1000 arasında değişen bir antikor konsantrasyonu ile) ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Daha sonra PBS / Triton X-100 ile üç kez (her biri 5-10 dakika) yıkayın.</li>
	<li>Slaytı bir lamel ile kaplamadan önce çekirdekleri etiketlemek için bir damla DAPI montaj ortamı uygulayın. Lameli yerleştirirken hava kabarcıklarından kaçının.</li>
	<li>Slaytı kontrol etmek ve görüntüleri yakalamak için bir floresan mikroskobu kullanın (bkz. NOT: Hücreler, hücreleri bulmak için 10x büyütmede ex/em 359/461'de DAPI ile yerleştirilmiştir; Daha yüksek büyütme hücreleri yakalayabilir. Diğer dalga boyları seçilen renge bağlı olacaktır. Yeşil renk (GFP) - eski / em 488/510. Kırmızı renk (Cy3)- ex/em 555/569.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina.">M&#252;ller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997 (2018).</li><li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

Yazarların bu makalenin içeriğiyle ilgili olduğunu beyan etmek için herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Primer retinal pigmente epitelin (RPE) farelerden izolasyonu daha önce laboratuvarımız tarafından belgelenmiştir. Bu el yazması, birincil Müller hücrelerinin izolasyonu için ayrıntılı bir gösteri protokolünü açıklamaktadır. Bu prosedür, fare gözlerinden izole edilen Müller hücrelerinin enükleasyonu, tedavisi, diseksiyonu, toplanması, tohumlanması, kültürü ve karakterizasyonunu içerir. Daha önceki yayınlarda bulunan daha önce başarılı bir protokole ve yakın tarihli bir yayında<sup clas...

Müller hücreleri (MC'ler), retina dokusunda bulunan ana ve en bol bulunan glial hücrelerdir. Retina içinde yapısal bütünlük ve metabolik fonksiyonların sağlanmasında kilit oyunculardırlar1. MC'lerin stratejik yapısı tüm retina kalınlığına yayılır ve böylece retinaya destek sağlar. İskele benzeri özelliklerine ek olarak, retinal nöronlar için metabolik işlevlere sahiptirler ve onlara glikoz ve laktat dahil olmak üzere enerji substratları sağlarlar. Bu işlevler, sağlıklı nöronal işlevi sürdürmek için çok önemlidir. Bozulmuş MC'lerin yaşa bağlı makula dejenerasyonu, diyabetik retinopati ve glokom 2,3 dahil olmak üzere çeşitli retina hastalıklarına katkıda bulunduğu bildirilmiştir. MC'ler retinada rejeneratif tedavi için endojen hücresel kaynaklar olabilir1. Ayrıca retinanın önemli bir bölümünü oluştururlar ve güçlü kanıtlar, bazı türlerde bu hücrelerin eksik nöronların yerine geçecek şekilde uyarılabileceğini göstermektedir2. Nöronlarla faydalı bir şekilde işbirliği yaparlar ve konik olarak dallanan Müller hücrelerinin uç ayakları, kan damarlarını yoğun bir şekilde kınından çıkarır ve retinanın nöral bileşenlerini birbirine bağlar. Nöronal gelişimi ve nöronal plastisiteyi korumak için Müller hücreleri, nöronlar için yumuşak bir substrat görevi görür ve onları mekanik travmadankorur 3. Ek olarak, patolojik koşullar altında, Müller hücreleri, kayıp fotoreseptörleri ve nöronları kopyalayan veya yeniden üreten nöral progenitörlere veya kök hücrelere farklılaşabilir 2,3,4. Müller hücreleri, kendini yenileme ve farklılaşma için farklı potansiyel seviyeleri de dahil olmak üzere retinal kök hücrelerin özelliklerini korur 5,6. Müller glial hücresi, retinayı homeostazda tutmak için nörotrofik faktörler üreten, nörotransmiterleri alan ve geri dönüştüren, iyonları uzamsal olarak tamponlayan ve kan-retina bariyerini koruyan önemli bir retina soyuna sahiptir 7,8,9. Bu, Müller hücrelerinin retina dejenerasyonu ile ilgili hastalıkların tedavisinde hücre bazlı tedavilerde umut verici bir araç olarak potansiyelini vurgulamaktadır. Müller hücreleri, retina boyunca dağılan ve hem nöronlara hem de kan damarlarına bağlanan birincil gliadır. Retina hücrelerinin canlılığını ve stabilitesini korumak için gerekli yapısal ve metabolik desteği sağlayarak çok önemli bir koruyucu rol oynarlar. Ne yazık ki, literatürde retinadan primer Müller hücre izolasyonu için çok az protokol bulunmaktadır10,11.
Fare birincil Müller hücrelerini güvenilir bir şekilde izole etmek ve kültürlemek için gelişmiş bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol grubumuzda Müller hücrelerini vahşi tip C57BL/6 farelerden ve transgenik farelerden izole etmek için kullanıldı12,13. Bu protokol için 5 ila 11 günlük yaşları arasında, cinsiyet tercihi olmayan fareler kullanılır. Hücreler 4 defaya kadar geçilmiştir; bununla birlikte, P4'te şişeye yapışmayı bırakırlar ve sağlıklı bir kültür yetiştirmek zorlaşır. Kültür genellikle Retina Pigmentli Epitel (RPE) hücreleri ile kontamine olur, bu nedenle hücre hattı üzerinde herhangi bir ek deney yapmadan önce hücreler en az bir kez geçilmelidir. Geçiş, kirleticilerden daha fazla izolasyon sağlar. Bu nedenle, sunulan protokol, fare Müller hücrelerini izole etmek için hızlı ve etkili bir yol sunar, bu da daha sonra terapötik hedefleri araştırmak ve retina hastalıkları için potansiyel tedavileri değerlendirmek için güvenilir bir platform olarak kullanılabilir14.

<table><tbody><tr><td>Beaker : 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV&amp;nbsp;</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media to grow M&amp;uuml;ller cells&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>For complete Muller cell culture media</td></tr><tr><td>Glutamine synthase</td><td>Cell signalling</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td><td>B-D</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>For complete M&amp;uuml;ller cell culture media</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62851.AP</td><td></td></tr><tr><td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 Centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 15mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 50mL</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td><td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Underpads, Moderate : 23&quot; X 36&quot;</td><td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&amp;nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

Retinanın birincil destek hücresi retinal glial Müller hücresidir. Tüm retina yüzeyini kaplarlar ve hem retina kan damarlarına hem de retina nöronlarına yakındırlar. Büyümeleri nedeniyle Müller hücreleri, sağlıklı bir retinada nörotransmiterlerin, retinoik asit bileşiklerinin ve iyonların (potasyum K+ gibi) alımı ve geri dönüşümü dahil olmak üzere birçok önemli görevi yerine getirir. Kan akışını düzenlemenin ve kan-retina bariyerini korumanın yanı sıra, metabolizmayı ve retinaya besin tedarikini de düzenlerler. Birincil fare Müller hücrelerini izole etmek için yerleşik bir prosedür bu el yazmasında sunulmuştur. Oküler bozuklukların çeşitli fare modellerinde yer alan altta yatan moleküler süreçleri daha iyi anlamak için Müller hücre izolasyonu mükemmel bir yaklaşımdır. Bu el yazması, farelerden Müller hücre izolasyonu için ayrıntılı bir prosedürü özetlemektedir. Enükleasyondan tohumlamaya kadar tüm süreç yaklaşık birkaç saat sürer. Tohumlamadan sonraki 5-7 gün boyunca, izole edilen hücrelerin engellenmeden büyümesine izin vermek için ortam değiştirilmemelidir. Morfoloji ve farklı immünofloresan belirteçler kullanılarak hücre karakterizasyonu süreçte daha sonra gelir. Hücreler için maksimum geçişler 3-4 katıdır.

İzole edilmiş Müller hücrelerinin özgüllüğünün, saflığının ve bariyer fonksiyonunun doğrulanması İzole edilen Müller hücrelerinin canlılığını, morfolojisini ve ayırt edici niteliklerini doğrulamak için, hücreler bir ışık mikroskobu altında incelendi. P0 ve P1 görüntüleri kaydedildi (Şekil 1A). İzole Müller hücrelerinin RPE hücreleri ile kontaminasyonunu kontrol etmek ve saflığını doğrulamak için, RPE hücre markörü RPE65'e ?...

Bu el yazması, fare gözlerinden retinal glial Müller hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonu ve diseksiyonu ile başlar, ardından Müller hücrelerinin izolasyonu, tohumlanması ve kültürlenmesi ile devam eder.

Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

1.2K Görüntüleme.  Oakland University. Bu el yazması, fare gözlerinden retinal glial Müller hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonu ve diseksiyonu ile başlar, ardından Müller hücrelerinin izolasyonu, tohumlanması ve kültürlenmesi ile devam eder.

Video: Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Biyomühendislik

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Biyoloji

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates such as fish, MG-driven regeneration occurs naturally; in mammals, however, stimulation with certain factors or genetic/epigenetic manipulation is required. Since MG comprise only 5% of the retinal cell population, there is a need for model systems that allow the study of this cell population exclusively. One of these model systems is primary MG cultures that are reproducible and can be used for a variety of applications, including molecule/factor screening and identification, testing of compounds or factors, cell monitoring, and/or functional tests. This model is used to study the potential of murine MG to convert into retinal neurons after supplementation or inhibition of microRNAs (miRNAs) via transfection of artificial miRNAs or their inhibitors. The use of MG-specific reporter mice in combination with immunofluorescent labeling and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) confirmed that 80%-90% of the cells found in these cultures are MG. Using this model, it was discovered that miRNAs can reprogram MG into retinal progenitor cells (RPCs), which subsequently differentiate into neuronal-like cells. The advantages of this technique are that miRNA candidates can be tested for their efficiency and outcome before their usage in in vivo applications.

M&#252;ller glia primary cultures obtained from mouse retinas represent a very robust and reliable tool to study the glial conversion into retinal progenitor cells after microRNA treatment. Single molecules or combinations can be tested before their subsequent application of in vivo approaches.

MikroRNA Tedavisi Sonrası Murine Müller Glia'nın Rejenerasyon Potansiyelini İncelemek için Birincil Hücre Kültürleri

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Gelişim Biyolojisi

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Nörobilim

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Kültürlenmiş Primer Murin RPE'nin Karakterizasyonu ve Morfolojik Dinamiği

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Yazar Spotlight: Retinopati Araştırmaları için Yetişkin Farelerden Primer Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli İzolasyonu

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Submukoza ve Lamina Propria yetişkin fare enterik gliyal hücrelerini izolasyon

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

MikroRNA Tedavisi Sonrası Murine Müller Glia'nın Rejenerasyon Potansiyelini İncelemek için Birincil Hücre Kültürleri

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

Submukoza ve Lamina Propria yetişkin fare enterik gliyal hücrelerini izolasyon