تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعيون (NEI) ، صندوق المعهد الوطني للعيون (NEI) R01 EY029751-04. نود أن نعرب عن تقديرنا للدكتورة سيلفيا ب. سميث حيث تم تعديل هذا البروتوكول بناء على بروتوكولها الخاص بعزل خلايا مولر.

تتوافق جميع التجارب مع مع بيان ARVO لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية وتم إجراؤها وفقا لبروتوكول المعتمد من قبل معهد رعاية ولجنة استخدامه (IACUC) وسياسات جامعة أوكلاند (رقم البروتوكول 2022-1160)
1. وسائل الإعلام وإعداد الحلول
<ol><li>تحضير محلول عين خلية مولر عن طريق استكمال وسط النسر المعدل Dulbecco (DMEM ، التفاصيل في جدول المواد) مع البنسلين / الستربتومايسين بتخفيف 1: 1000. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى 10 مل من DMEM ، أضف 10 ميكرولتر من البنسلين / الستربتومايسين. ملاحظة: هذه وسائط بسيطة خالية من المصل تم إعدادها. أيضا ، قم بتسخين الوسائط الكاملة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية قبل استخدامه لعمل زراعة الخلايا.</li>
	<li>تحضير وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة عن طريق استكمال DMEM بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS ، معطل بالحرارة) ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. على سبيل المثال (500 مل من وسائط DMEM + 50 مل من FBS + 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين).</li>
	<li>تحضير محلول Trypsin-EDTA بنسبة 0.05٪ مع كولاجيناز IV بتركيز 200 وحدة / مل (يستخدم Trypsin-EDTA لإذابة الكمية المحسوبة من مسحوق Collagenase IV للوصول إلى التركيز المطلوب).</li>
</ol>2. الاستئصال
<ol><li>القتل الرحيم للفأر أخلاقيا باستخدام استنشاق CO2 باتباع إرشادات IACUC.<ol><li>باختصار ، ضع () في غرفة CO2 لإدخال 100٪ CO2 بمعدل ملء 30-70٪ من حجم الغرفة / دقيقة مع CO2 لتحقيق هدف فقدان الوعي السريع في غضون 2-3 دقائق مع الحد الأدنى من الضيق للفئران.</li>
		<li>نظرا لأن الفئران في سن مبكرة (~ 10 أيام) ، فقم بإجراء خلع عنق الرحم كطريقة ثانوية لضمان القتل الرحيم المناسب.</li>
	</ol></li>
	<li>بعد تعقيم منطقة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ضع الماوس على وسادة سفلية معقمة.</li>
	<li>اقتطع العينين عن طريق وضع أذرع الملقط في الجزء الخلفي من العين ، والسحب برفق من المنطقة المدارية ، واستئصال العينين عن طريق الضغط باستخدام ملاقط نمط 5/45 على المنطقة المدارية لإحداث البروبتوس. ملاحظة: تعقيم أدوات التشريح ب 70٪ إيثانول متبوعا بمحلول ملحي عازل للفوسفات قبل التشريح.</li>
	<li>تأكد من أن العصب البصري لا يزال متصلا بالعين عن طريق استئصال العين ببطء. تأكد من سحب العصب البصري (المعروف بصريا على أنه حبل أبيض) خلف العين. ملاحظة: لا يلزم إجراء هذه الخطوة تحت المجهر ، ويمكن إجراؤها على مقعد معقم.</li>
</ol>3. علاج العيون المنزوعة النواة
<ol><li>قم بتغطية أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل بورق الألمنيوم واملأ الأنبوب ب 10 مل من محلول عين خلية مولر.</li>
	<li>ضع العيون المقطعة في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على محلول عين خلية مولر واسمح لهما بالجلوس طوال الليل ، أو حوالي 18 ساعة ، في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>بعد 18 ساعة ، صب محلول العين وشطف العينين لفترة وجيزة مع 2-3 مل من المياه المالحة الدافئة (37 درجة مئوية) الفوسفاتية (PBS).</li>
	<li>صب برنامج تلفزيوني وحرك العينين إلى طبق بتري 100 مم يحتوي على 10 مل من محلول التربسين. (أعدت في الخطوة 1-3). ملاحظة: يستخدم التربسين على العين المنزوعة النواة بالكامل ، ويعمل كعامل انفصامي لتسهيل فصل الخلايا عن طبقات الشبكية أثناء التسلخ. تحتوي شبكية العين المقطعة على العديد من الخلايا ، بما في ذلك خلايا RPE ، وهي لزجة ومن المرجح أن تلوث مزرعة خلايا مولر14. أظهر الفحص المجهري بوضوح أنه بعد 5 أيام من العزلة (أثناء تغيير الوسائط الأول) ، انفصلت خلايا RPE عن اللوحة وماتت13. الوسائط المستخدمة لعزل RPE هي DMEM / F-12 ، بتركيبة مختلفة عن DMEM (المستخدمة في عزل خلايا مولر) ، والتي تحتوي على بيروفات الصوديوم وانخفاض الجلوكوز.</li>
	<li>ضع الطبق في حاضنة واحتضانه لمدة 1.5 إلى 2 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
	<li>بعد الحضانة ، انقل العينين إلى طبق بتري 60 مم يحتوي على ما يقرب من 5 مل من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة.</li>
</ol>4. تشريح
ملاحظة: يجب تنفيذ هذا الإجراء في البيئة المعقمة لغطاء الثقافة. وبالتالي ، من الضروري تعقيم أسطح غطاء المحرك تماما بنسبة 70٪ كحول ، إلى جانب جميع الأدوات ومجهر التشريح. تجدر الإشارة إلى أنه تم تسجيل الفيديو خارج غطاء المحرك للحصول على رؤية أفضل وأغراض توضيحية أوضح.
<ol><li>ضع قطعة صغيرة من الأنسجة المعقمة من فئة المختبر في الطبق للمساعدة في استقرار العينين أثناء التسلخ. ضع العينين تحت مجهر تشريح لبدء التشريح. ملاحظة: يسهل استخدام الأنسجة المعملية مناورة العينين في طبق مملوء بالسوائل (وسائط كاملة) ، مما يضمن تشريحا دقيقا.</li>
	<li>استخدم مقص Vannas وملاقط على غرار M5S لإزالة النسيج الضام وعضلات العين والعصب البصري.<ol><li>أمسك العين باستخدام ملاقط على غرار M5S وقم بعمل شق في قسم ora serrata بمقص Vannas أو إبرة حقنة. ملاحظة: يوجد خط دائري أزرق فاتح بين الجزء الأمامي والخلفي من العين يسمى ora serrata ، والذي يمكن استخدامه كمعلم للتوجيه الدقيق أثناء التسلخ.</li>
		<li>أمسك الشق باستخدام ملاقط على غرار M5S واسحب القرنية أو تمزقها من الجزء الخلفي من العين. اسحب زيادات صغيرة لضمان بقاء سلامة الشبكية سليمة. ملاحظة: هذه الخطوات هي لإزالة الجزء الأمامي من العين (القرنية والقزحية والعدسة) من الجزء الخلفي من كأس العين (شبكية العين العصبية والمصطبغة).</li>
		<li>للحفاظ على سلامة طبقات الشبكية ، اسحب برفق وإزالة ظهارة الشبكية المصطبغة من الشبكية العصبية. يجب أن تكون الشبكية العصبية خالية من أي بقع سوداء لضمان نقاء العزل قدر الإمكان ، حيث أن طبقة RPE عادة ما تكون لزجة ومتصلة بالشبكية العصبية.</li>
		<li>قطع شبكية العين العصبية تشريح إلى قطع صغيرة قبل جمعها في لوحة لضمان انتشار متجانس للخلايا على اللوحة.</li>
	</ol></li>
	<li>صفيحة شبكية العين العصبية في دورق T25 يحتوي على 4 مل من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة.</li>
	<li>أخيرا ، ضع القارورة في حاضنة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
</ol>5. زراعة خلايا مولر الدبقية الأولية
<ol><li>لا تحرك القارورة لمدة 3-5 أيام لتعزيز نمو الخلايا.</li>
	<li>قم بتغيير الوسائط بعد اليوم الخامس وكل يومين بعد ذلك حتى تتلاقى الخلايا بنسبة 90٪.</li>
</ol>6. تمرير خلايا مولر الدبقية الأولية
<ol><li>نضح وسائط زراعة خلايا مولر ، متبوعا ب 2 مل من الغسيل في برنامج تلفزيوني ، واستنشاق PBS. أضف 2 مل من 0.25٪ Trypsin-EDTA (1x) ، أو ما يكفي لتغطية اللوحة.</li>
	<li>احتضان لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تأكد من فصل الخلايا عن اللوحة تحت المجهر. بعد ذلك ، اجمع معلق الخلية وأضف 4 مل من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة (المحضرة في الخطوة 1.2) إلى أنبوب التجميع.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 300 × غرام. بعد شفط المادة الطافية، أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة. نظرا لأن عدد الخلايا يمكن أن يختلف وفقا لعدد العيون التي تم تشريحها ، فمن الأفضل حساب الخلايا قبل البذر والحضانة. كثافة البذر الموصى بها هي 3.0 × 106 خلايا في قارورة T75. ملاحظة: يمكن تمرير الخلايا حتى 4-5 مرات. ومع ذلك ، تم العثور على نتائج التجربة الأكثر اتساقا بعد 1-2 مقاطع.</li>
</ol>7. التألق المناعي
ملاحظة: استخدم بروتوكول التألق المناعي لتلطيخ خصوصية خلية مولر والتحقق من صحتها. فيما يلي لمحة موجزة عن بروتوكول الفلورسنت المناعي. يتم تنفيذ هذه الخطوة بعد المقطع الأول12.
<ol><li>قم بزرع الخلايا في شريحة غرفة زراعة الخلايا (30000 خلية لكل بئر لشريحة غرفة ذات 8 آبار).</li>
	<li>استزراع الخلايا المعزولة لمدة 24-48 ساعة في وسط زراعة خلايا مولر الكامل (محضر في الخطوة 1.2) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
	<li>قم بنضح الوسائط وغسل شريحة الغرفة ب 250-300 ميكرولتر من 1x PBS على كل بئر عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80-90٪.</li>
	<li>ثبت الشريحة لمدة 10 إلى 15 دقيقة في 250-300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد على كل بئر ، متبوعا بالغسيل باستخدام PBS / TX-100 (5 دقائق لكل منهما / 3x).</li>
	<li>أضف حاجزا حاجزا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية (انظر جدول المواد).</li>
	<li>نضح محلول الحجب ، ثم أضف الأجسام المضادة الأولية الخاصة بخلايا مولر لتأكيد نقاء الخلايا المعزولة باستخدام إنزيم الجلوتامين سينثيتاز وفيمنتين5،12. احتضان لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية (باستخدام تركيز الأجسام المضادة من 1: 100-1: 200 في حجب المخزن المؤقت في حجم 150-200 ميكرولتر / شريحة). اغسل الشريحة بغسلة PBS / TX-100 (5 و 10 دقائق لكل منهما). ملاحظة: تم اختيار هذه الأجسام المضادة لأنها علامات مميزة لتحديد خلايا مولر وضمان نجاح ونقاء مزرعة خلايا مولر.</li>
	<li>أضف الجسم المضاد الثانوي (بتركيز جسم مضاد يتراوح من 1: 1000 في المخزن المؤقت المانع في 150-200 ميكرولتر / شريحة) واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم اغسل باستخدام PBS / Triton X-100 ، ثلاث مرات (5-10 دقائق لكل منهما).</li>
	<li>ضع قطرة من وسيط تركيب DAPI لتسمية النوى قبل تغطية الشريحة بغطاء سليب. تجنب فقاعات الهواء عند وضع غطاء الغطاء.</li>
	<li>استخدم مجهر الفلورسنت للتحقق من الشريحة والتقاط الصور (انظر جدول المواد). ملاحظة: توجد الخلايا باستخدام DAPI عند ex / em 359/461 عند تكبير 10x لتحديد موقع الخلايا ؛ يمكن للتكبير العالي التقاط الخلايا. تعتمد الأطوال الموجية الأخرى على اللون المختار. اللون الأخضر (GFP) - ex / em 488/510. اللون الأحمر (Cy3) - ex / em 555/569.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina.">M&#252;ller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997 (2018).</li><li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عن صلة بمحتوى هذه المقالة.

تم توثيق عزل ظهارة الشبكية المصطبغة الأولية (RPE) من الفئران سابقا من قبل مختبرنا. تصف هذه المخطوطة بروتوكولا توضيحيا مفصلا لعزل خلايا مولر الأولية. يتضمن هذا الإجراء الاستئصال والعلاج والتشريح والجمع والبذر والثقافة وتوصيف خلايا مولر المعزولة من عيون الفئران. يعتمد على بروتوكول ناجح سابق...

خلايا مولر (MCs) هي الخلايا الدبقية الرئيسية والأكثر وفرة الموجودة في أنسجة الشبكية. هم اللاعبون الرئيسيون في توفير السلامة الهيكلية ووظائف التمثيل الغذائي داخل شبكية العين1. ينتشر الهيكل الاستراتيجي ل MCs عبر سمك الشبكية بالكامل ، مما يوفر الدعم لشبكية العين. بالإضافة إلى خصائصها الشبيهة بالسقالات ، فإن لها وظائف التمثيل الغذائي للخلايا العصبية في شبكية العين ، وتزودها بركائز الطاقة ، بما في ذلك الجلوكوز واللاكتات. هذه الوظائف حاسمة من أجل الحفاظ على وظيفة عصبية صحية. تم الإبلاغ عن ضعف MCs للمساهمة في أمراض الشبكية المختلفة ، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، واعتلال الشبكية السكري ، والزرق2،3. يمكن أن تكون MCs مصادر خلوية داخلية للعلاج التجديدي في شبكية العين1. كما أنها تشكل جزءا كبيرا من شبكية العين ، وتشير الأدلة القوية إلى أنه في العديد من الأنواع ، يمكن تحفيز هذه الخلايا لتحل محل الخلايا العصبية المفقودة2. فهي تتعاون بشكل مفيد مع الخلايا العصبية ، وتفتح أقدام نهاية خلايا مولر المتفرعة مخروطيا الأوعية الدموية بكثافة وتربط المكونات العصبية لشبكية العين. من أجل الحفاظ على تطور الخلايا العصبية واللدونة العصبية ، تعمل خلايا مولر كركيزة ناعمة للخلايا العصبية ، وتحميها من الصدمات الميكانيكية3. بالإضافة إلى ذلك ، في ظل الظروف المرضية ، قد تتمايز خلايا مولر إلى أسلاف عصبية أو خلايا جذعية تكرر أو تجدد المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية المفقودة2،3،4. تحتفظ خلايا مولر بخصائص الخلايا الجذعية الشبكية ، بما في ذلك مستويات مختلفة من إمكانات التجديد الذاتي والتمايز 5,6. تحتوي خلية مولر الدبقية على سلالة شبكية كبيرة تنتج عوامل التغذية العصبية ، وتمتص وتعيد تدوير الناقلات العصبية ، وتخزن الأيونات مكانيا ، وتحافظ على حاجز الدم والشبكية من أجل الحفاظ على شبكية العين في التوازن7،8،9. هذا يسلط الضوء على إمكانات خلايا مولر كأداة واعدة في العلاجات القائمة على الخلايا لعلاج الأمراض المتعلقة بتنكس الشبكية. خلايا مولر هي الخلايا الدبقية الأولية الموزعة في جميع أنحاء شبكية العين ، وتتصل بكل من الخلايا العصبية والأوعية الدموية. إنها تلعب دورا وقائيا حاسما ، حيث توفر الدعم الهيكلي والأيضي الأساسي للحفاظ على صلاحية واستقرار خلايا الشبكية. لسوء الحظ ، تم العثور على عدد قليل جدا من البروتوكولات في الأدبيات الخاصة بعزل خلايا مولر الأولية من شبكية العين10,11.
نقدم نهجا محسنا لعزل وزراعة خلايا مولر الأولية للفأر بشكل موثوق. تم استخدام هذا البروتوكول في مجموعتنا لعزل خلايا مولر من الفئران من النوع البري C57BL / 6 والفئران المعدلة وراثيا12,13. يتم استخدام الفئران التي تتراوح أعمارها بين 5 و 11 يوما ، دون تفضيل الجنس ، لهذا البروتوكول. تم تمرير الخلايا حتى 4 مرات. ومع ذلك ، في P4 يتوقفون عن الالتزام بالقارورة ، ويصبح من الصعب تنمية ثقافة صحية. غالبا ما تكون المزرعة ملوثة بالخلايا الظهارية المصطبغة في شبكية العين (RPE) ، لذلك يجب تمرير الخلايا مرة واحدة على الأقل قبل إجراء أي تجارب إضافية على خط الخلية. يسمح المرور بمزيد من العزل عن الملوثات. لذلك ، يوفر البروتوكول المقدم طريقة سريعة وفعالة لعزل خلايا مولر الفأرية ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك كمنصة موثوقة للبحث عن الأهداف العلاجية وتقييم العلاجات المحتملة لأمراض الشبكية14.

<table><tbody><tr><td>Beaker : 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV&amp;nbsp;</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media to grow M&amp;uuml;ller cells&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>For complete Muller cell culture media</td></tr><tr><td>Glutamine synthase</td><td>Cell signalling</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td><td>B-D</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>For complete M&amp;uuml;ller cell culture media</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62851.AP</td><td></td></tr><tr><td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 Centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 15mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 50mL</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td><td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Underpads, Moderate : 23&quot; X 36&quot;</td><td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&amp;nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

الخلية الداعمة الأساسية للشبكية هي خلية مولر الدبقية في شبكية العين. وهي تغطي سطح الشبكية بالكامل وهي قريبة من كل من الأوعية الدموية في شبكية العين والخلايا العصبية في شبكية العين. بسبب نموها ، تؤدي خلايا مولر العديد من المهام الحاسمة في شبكية العين السليمة ، بما في ذلك امتصاص وإعادة تدوير الناقلات العصبية ومركبات حمض الريتينويك والأيونات (مثل البوتاسيوم K +). بالإضافة إلى تنظيم تدفق الدم والحفاظ على حاجز الدم والشبكية ، فإنها تنظم أيضا عملية التمثيل الغذائي وتزويد الشبكية بالمواد المغذية. يتم تقديم إجراء ثابت لعزل خلايا مولر الفأر الأولية في هذه المخطوطة. لفهم العمليات الجزيئية الأساسية التي تنطوي عليها نماذج الفئران المختلفة لاضطرابات العين بشكل أفضل ، يعد عزل خلايا مولر نهجا ممتازا. تحدد هذه المخطوطة إجراء مفصلا لعزل خلايا مولر عن الفئران. من الاستئصال إلى البذر ، تستغرق العملية برمتها حوالي بضع ساعات. لمدة 5-7 أيام بعد البذر ، لا ينبغي تغيير الوسائط للسماح للخلايا المعزولة بالنمو دون عوائق. يأتي توصيف الخلايا باستخدام التشكل وعلامات الفلورسنت المناعية المميزة بعد ذلك في هذه العملية. الحد الأقصى للممرات للخلايا هي 3-4 مرات.

التحقق من خصوصية ونقاء ووظيفة الحاجز لخلايا مولر المعزولة لتأكيد الصلاحية والتشكل والصفات المميزة لخلايا مولر المعزولة ، تم فحص الخلايا تحت المجهر الضوئي. تم تسجيل صور P0 و P1 (الشكل 1A). للتحقق من تلوث خلايا مولر المعزولة بخلايا RPE والتأكد من نقائها ، تم إجراء تلطي?...

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لعزل خلايا مولر الدبقية في شبكية العين عن عيون الفئران. يبدأ البروتوكول باستئصال وتشريح عيون الفأر ، يليه عزل خلايا مولر وبذرها وزراعتها.

عزل خلايا مولر الدبقية الدبقية لشبكية الفأر الأولية

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

1.2K Views.  Oakland University. تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لعزل خلايا مولر الدبقية في شبكية العين عن عيون الفئران. يبدأ البروتوكول باستئصال وتشريح عيون الفأر ، يليه عزل خلايا مولر وبذرها وزراعتها.

Video: عزل خلايا مولر الدبقية الدبقية لشبكية الفأر الأولية

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

عزل الخلايا العقدة الشبكية الفئران الأولية (رغس) عن طريق التدفق الخلوي

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Bioengineering

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates such as fish, MG-driven regeneration occurs naturally; in mammals, however, stimulation with certain factors or genetic/epigenetic manipulation is required. Since MG comprise only 5% of the retinal cell population, there is a need for model systems that allow the study of this cell population exclusively. One of these model systems is primary MG cultures that are reproducible and can be used for a variety of applications, including molecule/factor screening and identification, testing of compounds or factors, cell monitoring, and/or functional tests. This model is used to study the potential of murine MG to convert into retinal neurons after supplementation or inhibition of microRNAs (miRNAs) via transfection of artificial miRNAs or their inhibitors. The use of MG-specific reporter mice in combination with immunofluorescent labeling and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) confirmed that 80%-90% of the cells found in these cultures are MG. Using this model, it was discovered that miRNAs can reprogram MG into retinal progenitor cells (RPCs), which subsequently differentiate into neuronal-like cells. The advantages of this technique are that miRNA candidates can be tested for their efficiency and outcome before their usage in in vivo applications.

M&#252;ller glia primary cultures obtained from mouse retinas represent a very robust and reliable tool to study the glial conversion into retinal progenitor cells after microRNA treatment. Single molecules or combinations can be tested before their subsequent application of in vivo approaches.

مزارع الخلايا الأولية لدراسة إمكانات تجديد مورين مولر غليا بعد علاج الحمض النووي الريبي الميكروي

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Developmental Biology

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Neuroscience

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية للفأر عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا في النماذج الحيوانية لإزالة الميالين

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

التوصيف والديناميكا المورفولوجية للفأر الأولي المستزرع RPE

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

تسليط الضوء على المؤلف: العزل الفعال للخلايا الظهارية الصبغية الأولية في شبكية العين من الفئران البالغة لأبحاث اعتلال الشبكية

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

عزل الخلايا الدبقية المعوي من سوبموكوسا والصفيحة بروبريا الماوس الكبار

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

عزل خلايا مولر الدبقية الدبقية لشبكية الفأر الأولية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

عزل الخلايا العقدة الشبكية الفئران الأولية (رغس) عن طريق التدفق الخلوي

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

مزارع الخلايا الأولية لدراسة إمكانات تجديد مورين مولر غليا بعد علاج الحمض النووي الريبي الميكروي

توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية للفأر عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا في النماذج الحيوانية لإزالة الميالين

طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

عزل الخلايا الدبقية المعوي من سوبموكوسا والصفيحة بروبريا الماوس الكبار