Este trabalho foi apoiado pelo National Eye Institute (NEI), The National Eye Institute (NEI) fundo R01 EY029751-04. Gostaríamos de agradecer à Dra. Sylvia B. Smith, pois este protocolo foi modificado com base em seu protocolo de isolamento de células de Müller.

Todos os experimentos com animais estavam em conformidade com a declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual e foram feitos seguindo nosso protocolo animal aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e pelas políticas da Universidade de Oakland (número de protocolo 2022-1160)
1. Preparação de meios e soluções
<ol><li>Preparar a solução de olho de células de Müller suplementando o meio de Eagle modificado com Dulbecco (DMEM, pormenores na tabela de materiais) com penicilina/estreptomicina na diluição de 1:1000. Por exemplo, para 10 mL de DMEM, adicione 10 μL de penicilina/estreptomicina. NOTA: Este é um meio simples e sem soro preparado. Além disso, aqueça o meio completo em banho-maria a 37 °C antes de usá-lo para o trabalho de cultura de células.</li>
	<li>Prepare o meio de crescimento primário completo de células de Müller suplementando o DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS, inativado pelo calor) e 1% de penicilina/estreptomicina. Por exemplo (500 mL de meio DMEM + 50 mL de FBS + 5 mL de penicilina/estreptomicina).</li>
	<li>Prepare uma solução de tripsina-EDTA a 0,05% com colagenase IV a uma concentração de 200 U / mL (a tripsina-EDTA é usada para dissolver a quantidade calculada de pó de colagenase IV para atingir a concentração necessária).</li>
</ol>2. Enucleação
<ol><li>Eutanasiar eticamente o camundongo usando a inalação de CO2 seguindo as diretrizes da IACUC.<ol><li>Resumidamente, coloque o(s) animal(is) na câmara de CO2 para introduzir 100% de CO2 a uma taxa de preenchimento de 30-70% da câmara vol/min com CO2 para atingir o objetivo de inconsciência rápida dentro de 2-3 min com o mínimo de sofrimento para os camundongos.</li>
		<li>Como os camundongos são jovens (~ 10 dias), realize a luxação cervical como método secundário para garantir a eutanásia adequada.</li>
	</ol></li>
	<li>Depois de esterilizar a área de trabalho com etanol a 70%, coloque o mouse em uma almofada estéril.</li>
	<li>Extraia os olhos colocando os braços da pinça na parte de trás do olho, puxando suavemente da área orbital e enucleando os olhos aplicando pressão com uma pinça estilo 5/45 na área orbital para causar proptose. NOTA: Esterilize as ferramentas de dissecção com etanol a 70% seguido de solução salina tampão fosfato antes da dissecção.</li>
	<li>Certifique-se de que o nervo óptico ainda esteja conectado ao olho, enucleando o olho lentamente. Certifique-se de puxar o nervo óptico (visualmente identificado como um cordão branco) atrás do olho. NOTA: Esta etapa não precisa ser realizada ao microscópio e pode ser realizada em uma bancada esterilizada.</li>
</ol>3. Tratamento dos olhos enucleados
<ol><li>Cubra um tubo de centrífuga de 15 mL com papel alumínio e encha o tubo com 10 mL da solução de olho de células de Müller.</li>
	<li>Coloque os olhos dissecados no tubo de 15 ml contendo a solução ocular de células de Müller e deixe-os repousar durante a noite, ou cerca de 18 h, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após 18 h, decantar a solução para os olhos e enxaguar brevemente os olhos com 2-3 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) aquecida (37 °C).</li>
	<li>Transvasar o PBS e deslocar os olhos para uma placa de Petri de 100 mm contendo 10 ml de solução de tripsina. (preparado na etapa 1.3). NOTA: A tripsina é usada em todo o olho enucleado, atuando como um agente dissociativo para facilitar a separação celular das camadas da retina durante a dissecção. A retina dissecada tem muitas células, incluindo células RPE, que são pegajosas e mais propensas a contaminar a cultura de células de Müller14. O exame microscópico demonstrou claramente que, após 5 dias de isolamento (durante a primeira troca de meio), as células do EPR se desprenderam da placa e morreram13. O meio utilizado para isolamento de EPR é o DMEM/F-12, com composição diferente do DMEM (utilizado no isolamento de células de Müller), contendo piruvato de sódio e baixo teor de glicose.</li>
	<li>Coloque o prato em uma incubadora e incube por 1,5 a 2 h a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Após a incubação, transfira os olhos para uma placa de Petri de 60 mm contendo cerca de 5 mL de meio de crescimento primário completo de células de Müller.</li>
</ol>4. Dissecção
NOTA: Este procedimento deve ser realizado dentro do ambiente estéril da capela de cultura. Portanto, é essencial esterilizar completamente as superfícies do exaustor com álcool 70%, juntamente com todas as ferramentas e o microscópio de dissecação. Vale ressaltar que o vídeo foi gravado fora do capô para melhor visibilidade e demonstração mais clara.
<ol><li>Coloque um pequeno pedaço de tecido esterilizado de laboratório no prato para ajudar a estabilizar os olhos durante a dissecção. Coloque os olhos sob um microscópio de dissecação para iniciar a dissecção. NOTA: O uso de tecido de laboratório facilita a manobra dos olhos em um prato cheio de líquido (meio completo), garantindo uma dissecção precisa.</li>
	<li>Use uma tesoura Vannas e uma pinça estilo M5S para remover o tecido conjuntivo, os músculos extraoculares e o nervo óptico.<ol><li>Segure o olho com uma pinça estilo M5S e faça uma incisão na seção ora serrata com uma tesoura Vannas ou uma agulha de seringa. NOTA: Existe uma linha circular azul clara entre a parte anterior e posterior do olho chamada ora serrata, que pode ser usada como um ponto de referência para uma direção precisa durante a dissecção.</li>
		<li>Segure a incisão com uma pinça estilo M5S e puxe ou rasgue a córnea da parte posterior do olho. Puxe em pequenos incrementos para garantir que a integridade da retina permaneça intacta. NOTA: Essas etapas são para remover a parte anterior do olho (córnea, íris e cristalino) da parte posterior da ocular (retinas neurais e pigmentadas).</li>
		<li>Para manter a integridade das camadas da retina, puxe suavemente e remova o epitélio pigmentado da retina da retina neural. A retina neural deve estar livre de manchas pretas para garantir a pureza do isolamento o máximo possível, pois a camada de EPR geralmente é pegajosa e presa à retina neuronal.</li>
		<li>Corte a retina neural dissecada em pequenos pedaços antes de coletá-la em uma placa para garantir uma distribuição homogênea das células na placa.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocar as retinas neurais em um frasco T25 contendo 4 mL de meio de crescimento primário completo de células de Müller.</li>
	<li>Por fim, colocar o balão numa incubadora e incubar a 37 °C e 5% de CO2.</li>
</ol>5. Cultura de células gliais primárias de Müller
<ol><li>Não mova o frasco por 3-5 dias para promover o crescimento celular.</li>
	<li>Troque a mídia após o quinto dia e a cada dois dias até que as células estejam 90% confluentes.</li>
</ol>6. Passagem de células gliais primárias de Müller
<ol><li>Aspirar o meio de cultura de células de Müller, seguido de 2 ml de lavagem em PBS, e aspirar o PBS. Adicione 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% (1x), ou o suficiente para cobrir a placa.</li>
	<li>Incube por 5-10 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Certifique-se de que as células estejam separadas da placa sob o microscópio. Em seguida, recolha a suspensão celular e adicione 4 ml de meios de crescimento primários completos de células de Müller pré-aquecidos (37 °C) (preparados no passo 1.2) ao tubo de recolha.</li>
	<li>Centrifugue por 7 min a 300 x g. Depois de aspirar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mL de meio de crescimento primário completo de células de Müller. Como o número de células pode variar de acordo com o número de olhos dissecados, é melhor contar as células antes da semeadura e incubação. A densidade de semeadura recomendada é de 3,0 x 106 células em um balão T75. NOTA: As células podem ser passadas até 4-5 vezes. No entanto, os resultados mais consistentes do experimento são encontrados após 1-2 passagens.</li>
</ol>7. Imunofluorescência
NOTA: Use o protocolo de imunofluorescência para corar e validar a especificidade das células de Müller. Aqui está uma breve visão geral do protocolo de imunofluorescência. Esta etapa é realizada após a primeira passagem12.
<ol><li>Semeie as células em uma lâmina de câmara de cultura celular (30.000 células por poço para uma lâmina de câmara de 8 poços).</li>
	<li>Cultivar as células isoladas durante 24-48 h num meio de cultura de células Müller completo (preparado no passo 1.2) a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Aspire o meio e lave a lâmina da câmara com 250-300 μL de 1x PBS em cada poço quando as células estiverem 80-90% confluentes.</li>
	<li>Fixe a lâmina por 10 a 15 min em 250-300 μL de paraformaldeído a 4% em cada poço, seguido de lavagem com PBS / TX-100 (5 min cada / 3x).</li>
	<li>Adicionar tampão de bloqueio durante 1 h a 37 °C (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Aspirar a solução de bloqueio e, em seguida, adicionar os anticorpos primários específicos para as células de Müller para confirmar a pureza das células isoladas utilizando glutamina sintetase e vimentina 5,12. Incubar durante 3 h a 37 °C (utilizando uma concentração de anticorpos de 1:100-1:200 em tampão de bloqueio num volume de 150-200 μL/lâmina). Lave a lâmina com PBS/TX-100 lavagens (5 e 10 min cada). NOTA: Esses anticorpos foram escolhidos por serem características para identificar células de Müller e garantir o sucesso e a pureza da cultura de células de Müller.</li>
	<li>Adicione o anticorpo secundário (com uma concentração de anticorpos variando de 1:1000 em tampão de bloqueio em 150-200 μL / lâmina) e incube por 1 h a 37 ° C. Em seguida, lave com PBS / Triton X-100, três vezes (5-10 min cada).</li>
	<li>Aplique uma gota de meio de montagem DAPI para rotular os núcleos antes de cobrir a lâmina com uma lamínula. Evite bolhas de ar ao colocar a lamínula.</li>
	<li>Use um microscópio fluorescente para verificar a lâmina e capturar imagens (consulte a Tabela de Materiais). NOTA: As células estão localizadas com DAPI em ex/em 359/461 com ampliação de 10x para localizar células; maior ampliação pode capturar células. Outros comprimentos de onda dependeriam da cor escolhida. Cor verde (GFP) - ex/em 488/510. Cor vermelha (Cy3) - ex / em 555/569.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997 (2018).</li><li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse relevantes para o conteúdo deste artigo.

O isolamento do epitélio pigmentado primário da retina (EPR) de camundongos foi previamente documentado por nosso laboratório. Este manuscrito descreve um protocolo de demonstração detalhado para o isolamento primário de células de Müller. Este procedimento envolve enucleação, tratamento, dissecação, coleta, semeadura, cultura e caracterização de células de Müller isoladas de olhos de camundongos. Baseia-se em um protocolo previamente bem-sucedido encontrado em publicações anteriores e em nosso protocol...

As células de Müller (MCs) são as principais e mais abundantes células gliais encontradas no tecido retiniano. Eles são os principais atores no fornecimento de integridade estrutural e funções metabólicas dentro da retina1. A estrutura estratégica dos MCs está espalhada por toda a espessura da retina, fornecendo suporte à retina. Além de suas propriedades semelhantes a andaimes, eles têm funções metabólicas para os neurônios da retina, fornecendo-lhes substratos energéticos, incluindo glicose e lactato. Essas funções são cruciais para manter a função neuronal saudável. Foi relatado que MCs prejudicados contribuem para várias doenças da retina, incluindo degeneração macular relacionada à idade, retinopatia diabética e glaucoma 2,3. Os MCs podem ser fontes celulares endógenas para terapia regenerativa na retina1. Eles também compreendem uma porção significativa da retina, e fortes evidências sugerem que, em várias espécies, essas células podem ser estimuladas a substituir os neurônios ausentes2. Eles colaboram beneficamente com os neurônios, e os pés finais das células de Müller com ramificações cônicas desembainham densamente os vasos sanguíneos e conectam os componentes neurais da retina. Para manter o desenvolvimento neuronal e a plasticidade neuronal, as células de Müller atuam como um substrato macio para os neurônios, protegendo-os de traumas mecânicos3. Além disso, em circunstâncias patológicas, as células de Müller podem se diferenciar em progenitores neurais ou células-tronco que replicam ou regeneram os fotorreceptores e neurônios perdidos 2,3,4. As células de Müller mantêm as características das células-tronco da retina, incluindo diferentes níveis de potencial de auto-renovação e diferenciação 5,6. A célula glial de Müller tem uma linhagem retiniana significativa que produz fatores neurotróficos, capta e recicla neurotransmissores, tampona espacialmente os íons e mantém a barreira hemato-retiniana para manter a retina em homeostase 7,8,9. Isso destaca o potencial das células de Müller como uma ferramenta promissora em terapias baseadas em células para o tratamento de doenças relacionadas à degeneração da retina. As células de Müller são a glia primária distribuída por toda a retina, conectando-se a neurônios e vasos sanguíneos. Eles desempenham um papel protetor crucial, fornecendo suporte estrutural e metabólico essencial para manter a viabilidade e estabilidade das células da retina. Infelizmente, muito poucos protocolos são encontrados na literatura para isolamento primário de células de Müller da retina10,11.
Apresentamos uma abordagem aprimorada para isolar e cultivar de forma confiável células primárias de Müller de camundongo. Este protocolo foi usado em nosso grupo para isolar células de Müller de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem e camundongos transgênicos12,13. Camundongos com idade entre 5 e 11 dias, sem preferência sexual, são utilizados para este protocolo. As células foram passadas até 4 vezes; no entanto, em P4 eles param de aderir ao frasco e torna-se difícil cultivar uma cultura saudável. A cultura é frequentemente contaminada com células epiteliais pigmentadas da retina (RPE), portanto, as células devem ser passadas pelo menos uma vez antes de realizar qualquer experimento adicional na linha celular. A passagem permite um maior isolamento de contaminantes. Portanto, o protocolo apresentado oferece uma maneira rápida e eficaz de isolar células de Müller de camundongos, que podem ser usadas como uma plataforma confiável para pesquisar alvos terapêuticos e avaliar possíveis tratamentos para doenças da retina14.

<table><tbody><tr><td>Beaker : 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV&amp;nbsp;</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media to grow M&amp;uuml;ller cells&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>For complete Muller cell culture media</td></tr><tr><td>Glutamine synthase</td><td>Cell signalling</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td><td>B-D</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>For complete M&amp;uuml;ller cell culture media</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62851.AP</td><td></td></tr><tr><td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 Centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 15mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 50mL</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td><td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Underpads, Moderate : 23&quot; X 36&quot;</td><td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&amp;nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

A principal célula de suporte da retina é a célula glial de Müller da retina. Eles cobrem toda a superfície da retina e estão próximos dos vasos sanguíneos da retina e dos neurônios da retina. Devido ao seu crescimento, as células de Müller realizam várias tarefas cruciais em uma retina saudável, incluindo a captação e reciclagem de neurotransmissores, compostos de ácido retinóico e íons (como potássio K + ). Além de regular o fluxo sanguíneo e manter a barreira hemato-retiniana, eles também regulam o metabolismo e o fornecimento de nutrientes para a retina. Um procedimento estabelecido para isolar células primárias de Müller de camundongo é apresentado neste manuscrito. Para entender melhor os processos moleculares subjacentes envolvidos nos vários modelos de camundongos de distúrbios oculares, o isolamento de células de Müller é uma excelente abordagem. Este manuscrito descreve um procedimento detalhado para o isolamento de células de Müller de camundongos. Da enucleação à semeadura, todo o processo dura cerca de algumas horas. Por 5-7 dias após a semeadura, o meio não deve ser alterado para permitir que as células isoladas cresçam sem impedimentos. A caracterização celular usando morfologia e marcadores imunofluorescentes distintos vem a seguir no processo. As passagens máximas para as células são de 3 a 4 vezes.

Validação da especificidade, pureza e função de barreira de células de Müller isoladas Para confirmar a viabilidade, morfologia e qualidades distintivas das células de Müller isoladas, as células foram examinadas ao microscópio óptico. As imagens P0 e P1 foram registradas (Figura 1A). Para verificar a contaminação das células de Müller isoladas com células RPE e confirmar sua pureza, a coloração por imunofluorescência (IF) foi realizada usando anticorpo...

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para isolar células gliais de Müller da retina de olhos de camundongos. O protocolo começa com a enucleação e dissecção dos olhos de camundongos, seguida de isolamento, semeadura e cultura de células de Müller.

Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

1.2K visualizações.  Oakland University. Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para isolar células gliais de Müller da retina de olhos de camundongos. O protocolo começa com a enucleação e dissecção dos olhos de camundongos, seguida de isolamento, semeadura e cultura de células de Müller.

Vídeo: Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Bioengenharia

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Biologia

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates such as fish, MG-driven regeneration occurs naturally; in mammals, however, stimulation with certain factors or genetic/epigenetic manipulation is required. Since MG comprise only 5% of the retinal cell population, there is a need for model systems that allow the study of this cell population exclusively. One of these model systems is primary MG cultures that are reproducible and can be used for a variety of applications, including molecule/factor screening and identification, testing of compounds or factors, cell monitoring, and/or functional tests. This model is used to study the potential of murine MG to convert into retinal neurons after supplementation or inhibition of microRNAs (miRNAs) via transfection of artificial miRNAs or their inhibitors. The use of MG-specific reporter mice in combination with immunofluorescent labeling and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) confirmed that 80%-90% of the cells found in these cultures are MG. Using this model, it was discovered that miRNAs can reprogram MG into retinal progenitor cells (RPCs), which subsequently differentiate into neuronal-like cells. The advantages of this technique are that miRNA candidates can be tested for their efficiency and outcome before their usage in in vivo applications.

M&#252;ller glia primary cultures obtained from mouse retinas represent a very robust and reliable tool to study the glial conversion into retinal progenitor cells after microRNA treatment. Single molecules or combinations can be tested before their subsequent application of in vivo approaches.

Culturas celulares primárias para estudar o potencial de regeneração de Murine Müller Glia após tratamento de MicroRNA

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Biologia do Desenvolvimento

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Neurociência

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Caracterização e Dinâmica Morfológica de RPE Murino Primário Cultivado

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Autor em destaque: Isolamento eficiente de células epiteliais pigmentares primárias da retina de camundongos adultos para pesquisa de retinopatia

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Culturas de células primárias do Mouse epithelium Retinal do Pigment

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Isolamento de células gliais entéricas da Submucosa e Propria do Lamina do rato adulto

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

Culturas celulares primárias para estudar o potencial de regeneração de Murine Müller Glia após tratamento de MicroRNA

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Culturas de células primárias do Mouse epithelium Retinal do Pigment

Isolamento de células gliais entéricas da Submucosa e Propria do Lamina do rato adulto