Amniyotik membrandan Lumikan ekstraksiyonu ve depolama sıcaklığının belirlenmesi

Bu yöntem, bol miktarda protein ve diğer faktörlerin elde edilmesi için yararlı olan protein ekstraksiyonu için basit bir teknik göstermeyi amaçlamaktadır. Bu teknik, amniyotik membranda bulunan diğer faktörleri ve proteinleri çıkarmak ve ayrıca hayvanlar ve bitkisel dokular gibi diğer kaynaklardan proteinler elde etmek için kullanılabilir. Amniyon bankasından elde edilen 100 miligram amniyotik zarı çözerek başlayın.

Çözüldükten sonra, bir Petri kabına 10 mililitre steril dengeli tuz çözeltisi ekleyin ve membranı iki dakika yıkayın. Daha sonra, kullanılan dengeli tuz çözeltisini bir beher içine çıkarın ve Petri kabında gliserol ortamı izi görünmeyene kadar işlemi tekrarlayın. Daha sonra, membrana 10 mililitre dispase II ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Kuluçkanın sonunda, bir lastik polis hücresi kazıyıcı ile mekanik bir deepitelizasyon gerçekleştirin. Ardından, deepitelizasyonu doğrulamak için membranı ters çevrilmiş bir mikroskop altında görselleştirin. Daha sonra, epitelden arındırılmış amniyotik membranı daha önce gösterildiği gibi steril dengeli tuz çözeltisi ile yıkayın ve iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.

Ardından, membranı içeren tüpü 40 dakika boyunca sıvı azot içine batırın. Sıvı azotla dondurma işleminden sonra, ince bir toz elde edilene kadar membranı eksi 85 santigrat derecede önceden soğutulmuş bir harçta iki ila üç dakika manuel olarak öğütün. Daha sonra, 2.5 mililitre proteaz inhibitörü çözeltisi ekleyin ve ince toz haline getirilmiş membranı çözün.

Harç duvarlarını bir neşter bıçağı yardımıyla temizleyin ve karışımı beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü 30 saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra, doku karışımını önce dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 34 G'de santrifüj yaparak ve hemen dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 3.360 G'de tekrar santrifüj ederek homojenize edin.

Santrifüjlemenin sonunda, amniyotik membran ekstresi olan süpernatanı yeni bir tüpte toplayın. Daha sonra, çeşitli zaman noktaları ve sıcaklıklar için farklı bir iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde 0.7 mililitre aliquot. Amniyotik membran ekstraktındaki toplam protein miktarı ve lumikan konsantrasyonu zaman ve depolama koşullarından etkilenmiştir.

Bazal protein konsantrasyonu tüm amniyotik membran ekstraktları arasında benzerdi. Bununla birlikte, dört santigrat derecede 32 gün ve eksi 20 santigrat derecede 20 gün boyunca depolanan ekstraktta önemli ölçüde yüksek bir protein konsantrasyonu kaydedildi. Amniyotik membran ekstraktındaki Lumikan, 12 günlük bir süre boyunca saklanan numunede, dört ve eksi 20 santigrat derecede 30, 20 ve altı gün boyunca saklanan örneklerle karşılaştırıldığında anlamlı derecede daha yüksekti.

Bu sonuçlar, en yüksek lumikan konsantrasyonunu elde etmek için uygun depolama süresinin ve sıcaklığının eksi 20 santigrat derecede 12 gün olduğunu göstermiştir. Dondurulmuş amniyotik membranı topraklarken azami özen gösterin. Topraklama, harçtan düşebileceği için yumuşak olmalıdır.

Amniyotik membran ekstraktı lumikanının kornea epitel hücrelerindeki rolünü belirlemek ve kornea reepitelizasyonu için ideal lumikan dozunu belirlemek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.