양막에서 Lumican 추출 및 보관 온도 결정

이 방법은 풍부한 단백질 및 기타 요인을 얻는 데 유용한 단백질 추출을위한 간단한 기술을 입증하는 것을 목표로합니다. 이 기술은 양막에 존재하는 다른 인자와 단백질을 추출하고 동물 및 식물 조직과 같은 다른 공급원에서 단백질을 얻는 데 사용할 수 있습니다. 양막 은행에서 얻은 양막 100 밀리그램을 해동하여 시작하십시오.

해동되면 멸균 균형 잡힌 소금 용액 10ml를 페트리 접시에 넣고 2 분 동안 막을 씻습니다. 그런 다음 사용 된 균형 잡힌 소금 용액을 비커에 넣고 페트리 접시에 글리세롤 배지의 흔적이 보이지 않을 때까지 과정을 반복하십시오. 다음으로, 10 밀리리터의 dispase II를 멤브레인에 첨가하고 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 30 분 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 고무 경찰관 세포 스크레이퍼로 기계적 상피화를 수행하십시오. 그런 다음 도립 현미경으로 막을 시각화하여 상피화 제거를 확인합니다. 다음으로, 앞서 설명한 것처럼 멸균 균형 잡힌 소금 용액으로 탈 상피화 된 양막을 씻고 2 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 넣습니다.

이어서, 멤브레인을 함유하는 튜브를 액체 질소에 40분 동안 침지시킨다. 액체 질소로 동결 한 후, 미세한 분말이 얻어 질 때까지 섭씨 영하 85도에서 미리 냉각 된 모르타르에서 2-3 분 동안 수동으로 멤브레인을 분쇄합니다. 다음으로, 2.5 밀리리터의 프로테아제 억제제 용액을 첨가하고 미세하게 분말 화 된 막을 가용화시킨다.

메스 나이프를 사용하여 모르타르 벽을 청소하고 혼합물을 5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브를 30 초 동안 소용돌이. 이어서, 먼저 섭씨 4도에서 20분 동안 34G에서 원심분리하고, 즉시 섭씨 4도에서 20분 동안 3, 360G에서 다시 원심분리하여 조직 혼합물을 균질화한다.

원심 분리가 끝나면 양막 추출물 인 상청액을 새 튜브에 모으십시오. 그런 다음 다양한 시점과 온도에 대해 다른 2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 0.7 밀리리터를 분취합니다. 양막 추출물의 총 단백질량과 루미칸 농도는 시간 및 저장 조건에 의해 영향을 받았다.

기초 단백질 농도는 모든 양막 추출물 사이에서 유사하였다. 그러나, 섭씨 4도에서 32일 동안 및 섭씨 영하 20도에서 20일 동안 보관된 추출물에서 상당히 높은 단백질 농도가 관찰되었다. 양막 추출물의 루미칸은 섭씨 영하 20도에서 30, 20, 6일 동안 보관된 샘플에 비해 12일 동안 보관된 샘플에서 유의하게 높았다.

이러한 결과는 루미칸의 최고 농도를 달성하기 위한 적절한 보관 시간과 온도가 섭씨 영하 20도에서 12일임을 시사했습니다. 얼어 붙은 양막을 접지하는 동안 최대한주의를 기울이십시오. 접지는 박격포에서 떨어질 수 있으므로 부드러워 야합니다.

각막 상피 세포에서 양막 추출물 루미칸의 역할을 결정하고 각막 재상피화를 위한 루미칸의 이상적인 용량을 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.