מיצוי לומיקן מממברנת מי השפיר וקביעת טמפרטורת האחסון שלו

שיטה זו נועדה להדגים טכניקה פשוטה למיצוי חלבונים, שימושית להשגת חלבונים שופעים וגורמים אחרים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחלץ גורמים וחלבונים אחרים הנמצאים בקרום מי השפיר וגם, כדי לקבל חלבונים ממקורות אחרים כגון בעלי חיים ורקמות צמחיות. מתחילים בהפשרה של 100 מיליגרם של קרום מי השפיר המתקבל מבנק האמניון.

לאחר ההפשרה, מוסיפים 10 מיליליטר מתמיסת המלח המאוזנת הסטרילית לצלחת פטרי ושוטפים את הממברנה במשך שתי דקות. לאחר מכן, הסר את תמיסת המלח המאוזנת המשומשת לתוך וחזור על התהליך עד שלא נראה זכר למדיום גליצרול בצלחת פטרי. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של dispase II לממברנה לדגור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 30 דקות.

בסוף הדגירה, לבצע דה-אפיתל מכני עם מגרד תא שוטר גומי. לאחר מכן, דמיינו את הממברנה מתחת למיקרוסקופ הפוך כדי לאשר דה-אפיתליאליזציה. לאחר מכן, לשטוף את קרום מי השפיר דה-אפיתל עם תמיסת מלח מאוזנת סטרילית כפי שהודגם קודם לכן, ומניחים אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר.

לאחר מכן, לטבול את הצינור המכיל את הממברנה בחנקן נוזלי במשך 40 דקות. לאחר הקפאה עם חנקן נוזלי, לטחון ידנית את הממברנה במשך שתיים עד שלוש דקות במכתש, מקורר מראש במינוס 85 מעלות צלזיוס, עד לקבלת אבקה דקה. לאחר מכן, להוסיף 2.5 מיליליטר של פתרון מעכב פרוטאז ו solubilize את הממברנה אבקה דקה.

מנקים את קירות הטיט בעזרת סכין אזמל ומעבירים את התערובת לצינור של חמישה מיליליטר. מערבבים את הצינור במשך 30 שניות. לאחר מכן, הומוגניות תערובת הרקמות על ידי צנטריפוגה ראשונה ב 34 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ומיד צנטריפוגה זה שוב ב 3, 360 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בסוף הצנטריפוגה, לאסוף את supernatant, שהוא תמצית קרום מי השפיר, בצינור חדש. לאחר מכן, aliquot 0.7 מיליליטר בצינור מיקרוצנטריפוגה אחר של שני מיליליטר עבור נקודות זמן וטמפרטורות שונות. כמות החלבון הכוללת והריכוז הלומיקן בתמצית קרום מי השפיר הושפעו מזמן ומתנאי אחסון.

ריכוז החלבון הבסיסי היה דומה בין כל תמציות מי השפיר. עם זאת, ריכוז חלבון גבוה משמעותית נצפה בתמצית שאוחסנה במשך 32 ימים בארבע מעלות צלזיוס ו -20 ימים במינוס 20 מעלות צלזיוס. לומיקן בתמצית קרום מי השפיר היה גבוה משמעותית בדגימה שאוחסנה לתקופה של 12 יום בהשוואה לדגימות שאוחסנו במשך 30, 20 ושישה ימים בארבע ומינוס 20 מעלות צלזיוס.

תוצאות אלה הציעו כי זמן האחסון והטמפרטורה המתאימים להשגת הריכוז הגבוה ביותר של לומיקן הוא 12 ימים במינוס 20 מעלות צלזיוס. יש לנקוט משנה זהירות בעת הארקת קרום מי השפיר הקפוא. ההארקה צריכה להיות עדינה מכיוון שהיא עלולה ליפול מהטיט.

נדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע את התפקיד של תמצית קרום מי השפיר lumican בתאי אפיתל הקרנית ולקבוע את המינון האידיאלי של lumican עבור אפיתל מחדש של הקרנית.