Tünelleme nanotüplerine özgü belirteçlerin eksikliği, alandaki ilerlemeyi kısıtlar ve tünelleme nanotüplerini tanımlamak, karakterize etmek ve ölçmek için bir yönteme olan talep artmaktadır. Otomatik algılama yöntemlerinin bir algoritma geliştirme ve / veya mevcut algoritmayı değiştirme uzmanlığı olmadan uygulanması zordur, ancak manuel yöntemimizin daha iyi bir hassasiyetle uygulanması kolaydır. Tünelleme nanotüpleri yoluyla uzun menzilli hücreler arası transfer, nörodejeneratif patoloji, viral yayılma ve kanser dahil olmak üzere çeşitli hastalık modellerinde çeşitli şekillerde uygulanır.
Bu nedenle, nanotüplerin patogenezdeki rollerini anlamak için tünelleme çalışmaları önemlidir. Boyama işlemi sırasında tünelleme nanotüplerinin kırılması mümkündür. Kapak kaymaları kullanmaktan ve slaytlara monte etmekten kaçının, bunun yerine cam tabanlı görüntüleme kapları kullanın.
Modifiye fiksasyon protokolü, tünelleme nanotüplerinin bozulmadan kalmasına yardımcı olur. Prosedürü gösteren, Sangeeta NAF laboratuvarından doktora öğrencisi olan Deepak KV olacak. Başlamak için, kontrol ve oligomerik A-beta ile tedavi edilen hücreleri, fiksasyondan önce iki dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın.
Karnovsky'nin fiksatif çözeltisini, pH 7.2'nin 0.1 molar fosfat tamponunda çözünmüş% 2 formalin fiksatif ve% 2.5 glutaraldehit kullanarak hazırlayın. Ardından, Karnovsky'nin fiksatif çözeltisini oda sıcaklığında 45 dakika ekleyerek görüntüleme kabındaki hücreleri sabitleyin. Kuluçka tamponunu, beş mililitre FBS'de 0.1 gram saponin çözerek ve 95 mililitre PBS ekleyerek seyrelterek hazırlayın.
Daha sonra iki dakika boyunca inkübasyon tamponu kullanarak sabit hücreleri iki kez yıkayın. Fiksasyondan sonra, fosfo-PAK1'e karşı ilk antikoru ekleyin, inkübasyon tamponuna bir ila 250 seyreltme ekleyin ve karanlık, nemli bir odada dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. 24 saatlik inkübasyondan sonraki ertesi gün, hücreleri iki dakika boyunca inkübasyon tamponu ile iki kez yıkayın.
Daha sonra Alexa Fluor 488 ve Phalloidin 555'e konjuge edilmiş ikincil antikor ekleyin. Karanlık, nemli odadaki hücreleri oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hücreleri iki dakika boyunca inkübasyon tamponu ile iki kez yıkayın.
DAPI'yi bir ila 2000 seyreltmeye ekleyerek çekirdeği sabitleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında beş ila 10 dakika kuluçkaya yatırın. DABCO montaj ortamını, %90 gliserol ve %10 PBS'de 25 miligram DABCO kullanarak hazırlayın. Düzgün bir şekilde çözünmesi için, spektrofotometrik sınıf seyreltilmiş hidroklorik asit kullanarak pH'ı 8.6'ya ayarlayın ve çözeltiyi karıştırmak için bir rocker üzerinde tutun.
Ağartma önleyici bir ajan olarak, DABCO montaj ortamını doğrudan alttaki kapak kaymasını içeren görüntüleme kabının üzerine ekleyin. En az bir ila iki saat bekleyin ve doğrudan konfokal görüntüleme yapmaya devam edin. Tünelleme nanotüplerini tanımlamak için, önce kanalları seçerek ve gerekli lazerleri pencerelerde sırayla tıklatarak konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak immünoboyalı hücrelerin Z-yığın görüntülerini yakalayın, konfokal yazılımda bir, iki ve üç parça izleyin.
Floresan kanallı diferansiyel parazit kontrast görüntülerini çekmek için bir izleme penceresinin altındaki TPMT seçeneğini tıklatın. Yazılımın Edinme sekmesini seçin, Z-yığını sekmesine tıklayın ve bir pencerenin açılmasını bekleyin. Ardından, çanağın altındaki hücreleri odaklamak için Canlı Tarama'yı tıklatın.
Odaklanmış görüntüyü ilk yığın olarak seçin ve ardından hücrenin en üst bölümünü görmek için yukarı odaklanın ve son yığın olarak seçin. Canlı taramayı durdurun ve hücrelerin kalınlığına bağlı olarak dilim sayısını ve aralıkları belirleyen yığınların adım boyutunu düzeltmek için En Uygun sekmesinin yanındaki sayıyı tıklatın. 405 nanometre, 488 nanometre ve 561 nanometre lazerlerle üç DAPI, FITC ve TRITC kanalının sıralı görüntülerini alın ve 1,02 mikrosaniyelik piksel bekleme süresiyle çekim yapın.
Hücre sınırını gözlemlemek için floresan kanallı DIC kanalındaki görüntüleri yakalayın. Analiz için Fiji yazılımında czi veri biçiminde kaydedilmiş konfokal görüntüleri açın. Görüntünün her bir Z-yığınını ve kanalını görmek için Hyperstack seçeneğini belirleyin.
Belirli bir ilgi alanı kanalının tam yığınını seçmek için kanalı ve Z yığını kaydırma çubuklarını kaydırın. Ardından, kanal çubuğunu kaydırarak önce F-aktin lekeli kanalı seçin ve her bir yığını tek tek görmek için Z-yığınlarını manuel olarak kaydırın. Z-yığınlarının alt kısımlarında görülebilen hücreleri birbirine bağlıyor gibi görünen ve görüntüleme kabının yüzeyine yakın olan F-aktin lekeli yapıları, Z'nin nörit olarak ikiye eşit olduğu şekilde tanımlayın.
Tünelleme nanotüplerini tanımlayın, F-aktin pozitif uçan hücreden hücreye kanallar, Z-yığınlarını Z'den üste doğru kaydırarak dörde eşittir. Z-yığınlarının alt kısımlarının yakınında yüzeye doğru nöritleri arayın ve Z-yığınlarının altıya eşit Z'de üste doğru kaydırılmasıyla kaybolmaya başladıklarını gözlemleyin. Fosfo-PAK1 pozitif tünelleme nanotüplerini, Z-yığınlarından gelen kanalların gezinme doğasını analiz ederek F-aktin pozitif tünelleme nanotüplerine benzer şekilde tanımlayın.
Fosfo-PAK1 boyaması F-aktin boyamasından daha zayıf olduğundan, Z'de dörde eşit ve Z'de altıya eşit fosfo-PAK1 boyalı tünelleme nanotüplerini arayın. Ayrıca, F-aktin ve fosfo-PAK1 lekeli tünelleme nanotüp yapılarının hücreler arasındaki membran kanalları olduğunu doğrulamak için DIC görüntülerini gözlemleyin. Ek olarak, tanımlanan tünelleme nanotüplerinin F-aktin ve fosfo-PAK1 birlikte boyanmış yapılar olduğunu doğrulamak için F-aktin ve fosfo-PAK1 kanallarını birleştirin.
Tünelleme nanotüplerini ölçmek için, toplam hücre sayılarını ve tanımlanan tünelleme nanotüplerini manuel olarak sayın ve sayıları yüzde olarak temsil edin. F-aktin ve beta III tübülin pozitif tünelleme nanotüplerini Z-yığını görüntülerinden gezinme kanalları gibi ayırt etmek için, F-aktin ve beta III tübülin kanallarını birleştirin, ardından birleştirilmiş görüntülerin Z-yığınlarını analiz edin. Sadece üçe eşit Z'de hafifçe görülebilen ve Z'de altıya eşit ve Z'de dokuza eşit belirgin olan F-aktin lekeli tünelleme nanotüplerini arayın.
Benzer şekilde, F-aktin ve beta III tübülini tanımlayın. Z'de altıya eşit ve Z'de dokuza eşit olan uçan kanallar gibi çift pozitif tünelleme nanotüpleri. Diğer F-aktin ve beta III tübülin lekeli, Z-yığınlarının alt kısımlarından havada asılı durmayan çıkıntıları tanımlayın.
Fiji'deki Line aracını kullanarak tünelleme nanotüplerinin çapını ölçün. Analiz Et'i tıklatarak ölçüm ölçeğini doğrulayın ve ardından ölçeği piksel cinsinden mesafenin czi görüntülerinden otomatik olarak ayarlanması için ayarlayın. XY düzlemindeki tünelleme nanotüplerinin çaplarını ölçün.
3D yeniden dilimleme ve eşik özellikli 3D görselleştirmeye izin veren Fiji'deki Volume Viewer eklentisini kullanarak, Z-stack görüntülerini ayrı kanallara bölün. Ardından, bir seferde bir veya iki tünelleme nanotüpünü veya nöritini vurgulamak için 3D rekonstrüksiyon görünümünü kullanmak üzere tek kanallı Z-yığını görüntülerini kırpın. XY düzleminde tek bir tünelleme nanotüplerini veya nöritini sabitleyin ve XZ ve YZ erişim kesitlerini işaretleyin.
XZ düzleminin altındaki nöritleri, XZ ve YZ düzlemlerini ve üst Z-yığınlarındaki tünelleme nanotüplerini gözlemleyin. XZ düzleminde 3B hacim görünümünü yeniden oluşturmak için tek tek tünelleme nanotüplerini veya nöritini seçin. 3D rekonstrüksiyonda, Z-düzleminin altındaki nöritleri ve alt Z-düzlemine dokunmadan iki hücreyi birbirine bağlayan gezinen yapılar olarak görünen tünelleme nanotüplerini gözlemleyin.
F-aktin ve fosfo-PAK1 ile immünoboyalı hücrelerin konfokal Z-yığın görüntüleri, tünelleme nanotüplerini tanımlamak için analiz edildi. Ayrıca, F-aktin ve fosfo-PAK1 lekeli tünelleme nanotüp yapılarının hücreler arasındaki membran kanalları olduğunu doğrulamak için DIC görüntüleri analiz edildi. Hücreler F-aktin ve beta III tübülin ile çift immünoboyalıydı ve tünelleme nanotüp benzeri F-aktin ve tünelleme nanotüp benzeri F-aktin ve beta III tübülin çift pozitif membran kanalları sadece F-aktin pozitif tünelleme nanotüplerinden ayırt edildi.
Fosfo-PAK1 ve F-aktin ile birlikte eksprese edilen tünelleme nanotüpleri, substratuma dokunmadan iki hücre arasında gezinme özelliklerine dayanarak 3D hacim görünümü görüntüleri oluşturarak diğer nöritlerin hücre çıkıntılarından ayırt edildi. Sağ fiksatif ajanın kullanımı önemlidir, çünkü numunenin kusurlu fiksasyonu hedef proteinlerin hızlı proteolitik yıkımına ve spesifik immünoreaktivitede azalmaya neden olabilir.
