La falta de marcadores específicos de nanotubos de túnel restringe el progreso en el campo y existe una creciente demanda de un método para identificar, caracterizar y cuantificar nanotubos de túnel. Los métodos de detección automática son difíciles de implementar sin la experiencia para desarrollar un algoritmo y / o cambiar el algoritmo existente, pero nuestro método manual es fácil de implementar con mejor precisión. La transferencia intercelular de largo alcance a través de nanotubos de túnel se implementa de varias maneras en varios modelos de enfermedades, incluida la patología neurodegenerativa, la propagación viral y el cáncer.
Por lo tanto, los estudios sobre nanotubos de túnel para comprender su papel en la patogénesis son importantes. Es posible que los nanotubos de túnel se rompan durante el proceso de tinción. Evite usar hojas de cobertura y montaje en las diapositivas, utilizando platos de imágenes con fondo de vidrio en su lugar.
El protocolo de fijación modificado ayuda a mantener intactos los nanotubos de túnel. Demostrando el procedimiento estará Deepak KV, un estudiante de doctorado del laboratorio de Sangeeta NAF. Para comenzar, lave las células de control y oligoméricas tratadas con A-beta dos veces con PBS durante dos minutos antes de la fijación.
Preparar la solución fijadora de Karnovsky utilizando fijador de formalina al 2% y glutaraldehído al 2,5% disuelto en tampón fosfato molar 0,1 de pH 7,2. Luego fije las células en la placa de imágenes agregando la solución fijadora de Karnovsky durante 45 minutos a temperatura ambiente. Prepare el tampón de incubación disolviendo 0.1 gramos de saponina en cinco mililitros de FBS y diluyéndolo agregando 95 mililitros de PBS.
Luego lave las celdas fijas dos veces usando tampón de incubación durante dos minutos. Después de la fijación, agregue el primer anticuerpo contra fosfo-PAK1, agregue una dilución de uno a 250 en el tampón de incubación e incube durante la noche a cuatro grados centígrados en una cámara oscura y húmeda. Al día siguiente, después de 24 horas de incubación, lave las células dos veces con el tampón de incubación durante dos minutos.
Luego agregue el anticuerpo secundario conjugado a Alexa Fluor 488 y Phalloidin 555. Incubar las células en la cámara oscura y húmeda durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave las células dos veces con tampón de incubación durante dos minutos.
Tiñe el núcleo agregando DAPI en una dilución de uno a 2000 e incubar durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Prepare el medio de montaje DABCO utilizando 25 miligramos de DABCO en 90% de glicerol y 10% de PBS. Para disolver correctamente, ajuste el pH a 8.6 usando ácido clorhídrico diluido de grado espectrofotométrico y mantenga la solución en un balancín para mezclar.
Como agente antiblanqueador, agregue el medio de montaje DABCO directamente sobre la placa de imagen que contiene el deslizamiento de la cubierta en la parte inferior. Espere al menos una o dos horas y proceda directamente a realizar imágenes confocales. Para identificar nanotubos de túnel, capture imágenes de pila Z de células inmunoteñidas utilizando un microscopio de escaneo láser confocal seleccionando primero los canales y haciendo clic secuencialmente en los láseres requeridos en la pista uno, pista dos y pista tres de Windows en el software confocal.
Haga clic en la opción TPMT debajo de la ventana de pista uno para tomar las imágenes de contraste de interferencia diferencial con canales de fluorescencia. Seleccione la pestaña Adquisición del software, haga clic en la pestaña Z-stack y espere a que se abra una ventana. A continuación, haga clic en Live Scan para enfocar las celdas en la parte inferior del plato.
Seleccione esa imagen enfocada como la primera pila y, a continuación, enfóquese hacia arriba para ver la parte superior de la celda y selecciónela como la última pila. Detenga el escaneo en vivo y haga clic en el número junto a la pestaña Óptimo para corregir el tamaño del paso de las pilas que determina el número de sectores y los intervalos en función del grosor de las celdas. Tome imágenes secuenciales de tres canales de DAPI, FITC y TRITC con láseres de 405 nanómetros, 488 nanómetros y 561 nanómetros y capture con un tiempo de permanencia de píxeles de 1,02 microsegundos.
Capture imágenes en el canal DIC con canales de fluorescencia para observar el límite celular. Abra las imágenes confocales guardadas en formato de datos czi en el software Fiji para su análisis. Seleccione la opción Hyperstack para ver cada Z-stack y canal de la imagen.
Desplácese por el canal y las barras de desplazamiento de la pila Z para seleccionar la pila exacta de un canal de interés en particular. Luego seleccione primero el canal teñido de actina F desplazándose por la barra de canales y desplácese manualmente por las pilas Z para ver cada pila una por una. Identifique las estructuras teñidas con actina F que parecen estar conectando células que son visibles en las partes inferiores de las pilas Z y están cerca de la superficie de la placa de imágenes con Z igual a dos como neuritas.
Identifique los nanotubos de túnel, los conductos de célula a célula flotantes positivos de actina F desplazándose las pilas Z hacia la parte superior de Z es igual a cuatro. Busque neuritas cerca de las partes inferiores de las pilas Z hacia la superficie y observe que comienzan a desaparecer con el desplazamiento de las pilas Z hacia la parte superior en Z igual a seis. Identifique los nanotubos de túnel fosfo-PAK1 positivos de manera similar a los nanotubos de túnel positivos de actina F mediante el análisis de la naturaleza flotante de los conductos de las pilas Z.
Como la tinción de fosfo-PAK1 es más débil que la tinción de actina F, busque nanotubos de túnel teñidos con fosfo-PAK1 en Z igual a cuatro y en Z igual a seis. Además, observe las imágenes DIC para verificar que las estructuras de nanotubos de túnel teñidas con F-actina y fosfo-PAK1 son conductos de membrana entre las células. Además, fusione los canales F-actina y fosfo-PAK1 para verificar que los nanotubos de túnel identificados son estructuras co-teñidas de F-actina y fosfo-PAK1.
Para cuantificar los nanotubos de túnel, cuente manualmente el número total de células y los nanotubos de túnel identificados y represente los números como porcentajes. Para distinguir los nanotubos de túnel positivos para la tubulina F y beta III como conductos flotantes de imágenes de pila Z, combine los canales de tubulina F y beta III, luego analice las pilas Z de las imágenes fusionadas. Busque exclusivamente nanotubos de túnel teñidos con actina F que sean apenas visibles en Z igual a tres y prominentes en Z igual a seis y Z igual a nueve.
Del mismo modo, identifique la actina F y la tubulina beta III. nanotubos de túnel doblemente positivos como conductos flotantes en Z igual a seis y Z igual a nueve. Identificar otras protuberancias no flotantes teñidas de actina F y beta III tubulina de las partes inferiores de las pilas Z.
Mida el diámetro de los nanotubos de túnel con la herramienta Line en Fiji. Verifique la escala de medida haciendo clic en Analizar y, a continuación, establezca la escala para que la distancia en píxeles se establezca automáticamente a partir de las imágenes czi. Mida los diámetros de los nanotubos de túnel en el plano XY.
Usando el complemento Volume Viewer en Fiji, que permite la resegmentación 3D y la visualización 3D habilitada para umbrales, divida las imágenes de la pila Z en canales individuales. A continuación, recorte las imágenes de pila Z de un solo canal para usar la vista de reconstrucción 3D para resaltar uno o dos nanotubos o neuritas de túnel a la vez. Fije un solo nanotubos de túnel o neurita en el plano XY y marque las secciones transversales de acceso XZ e YZ.
Observe las neuritas en la parte inferior del plano XZ, en los planos XZ y YZ, y los nanotubos de túnel en las pilas Z superiores. Seleccione los nanotubos de túnel individuales o la neurita para reconstruir la vista de volumen 3D en el plano XZ. En la reconstrucción 3D, observe las neuritas en la parte inferior del plano Z y los nanotubos de túnel que aparecen como estructuras flotantes que conectan dos células sin tocar el plano Z inferior.
Se analizaron imágenes confocales de pila Z de células inmunoteñidas con actina F y fosfo-PAK1 para identificar nanotubos de túnel. Además, se analizaron imágenes DIC para verificar que las estructuras de nanotubos de túnel teñidas con F-actina y fosfo-PAK1 eran conductos de membrana entre las células. Las células fueron inmunoteñidas doblemente con actina F y tubulina beta III y la actina F similar a nanotubos túnel y los conductos de membrana doble positivos de túnel tipo nanotubo F y tubulina beta III se distinguieron de solo nanotubos de túnel positivos para F-actina.
Los nanotubos de túnel coexpresados con fosfo-PAK1 y F-actina se distinguieron de las protuberancias celulares de otras neuritas mediante la construcción de imágenes de vista de volumen 3D basadas en su característica de flotar entre dos células sin tocar el sustrato. El uso del agente fijador correcto es importante ya que la fijación imperfecta de la muestra puede conducir a una rápida degradación proteolítica de las proteínas diana y una reducción de la inmunorreactividad específica.
